脑胶质瘤微流控芯片模型的构建及中药半枝莲药效评价应用研究（上）

脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤类型之一，占所有原发性脑肿瘤的近30%，所有恶性脑肿瘤的80%，中位生存时间约为12.5~15.0个月，手术切除、放疗、烷化剂化疗或靶向治疗是脑胶质瘤治疗主要手段。尽管近年来脑胶质瘤的生物学研究取得了很多进展，但并没有显著改善患者的治疗效果。目前，多数研究采用传统的细胞模型、肿瘤球体模型、以啮齿类动物为代表的体内模型评估药物的有效性，但这些模型不能真实预测药物在临床治疗的疗效，候选药物在Ⅰ期临床试验中的成功概率仅为3.4%，由于有效性不足和安全性差，最终阶段的失败率为54%。因此，迫切需要能够真实反映人类脑胶质瘤疾病特征、微环境及其对治疗药物的反应等特点的临床前模型。

微流控芯片技术能实现在特定形状的通道中精确操纵各种流体和化学参数，例如，营养物质、流速、压力、氧气和pH值，提供可控的培养条件，从而仿真模拟人体组织和器官的微观结构和功能特征，在脑胶质瘤相关研究如循环分离肿瘤细胞、药物筛选、胶质母细胞瘤进展和细胞定位、模拟肿瘤与血流、缺氧和血管生成之间的相互作用等具有广泛的应用。笔者应用脑胶质瘤细胞构建了一种模拟肿瘤微环境的脑胶质瘤微流控芯片模型，用两种抗肿瘤药物进行药效验证和模型评价，并进一步探究中药半枝莲提取液抗脑胶质瘤的疗效，以期为寻找治疗脑胶质瘤中药及其活性成分筛选提供技术支撑。

2.方法

2.1细胞培养

人神经胶质细胞瘤细胞（U251）购自于美国ATCC公司细胞库，用含有10% FBS和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM高糖培养基培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于后续实验。

2.2脑胶质瘤芯片模型的构建

使用Auto CAD软件设计、标准光刻法制作了3个并列平行微流控通道结构的U251微流控芯片模型，各通道间由微梯形柱结构隔开，中间通道为脑胶质细胞瘤通道，两侧为培养基或含药物培养基通道，如图1A所示。将密度为2×107 cells/ml的U251细胞混悬液加入脑胶质瘤通道中，两侧通道加入培养基或含药培养基，构成2D培养的脑胶质瘤模型；3D培养的脑胶质瘤模型则与等体积的基质胶（4℃）进行混合后，迅速将混合液加入脑胶质瘤通道中，并将芯片置于培养箱中孵育30 min后，分别取20 μl预热后的培养基加入两侧的微通道中。24 h后模型内2D和3D培养的细胞状态如图1B所示，模型内2D培养的细胞在芯片通道的底部贴壁生长，而3D培养的细胞则嵌在3D基质中不规则地生长。

2.3芯片上细胞活力评价

采用Calcein AM/PI染色试剂盒评价芯片模型内细胞的活力。首先，向介质通道中加入PBS溶液，洗涤3次，每次持续5 min，以去除模型内潜在的干扰物质。在避光条件下，按照1 000∶2∶3（V/V/V）的比例将PBS、Calcein-AM和PI混合，制备成Calcein AM/PI染色工作液。取20 μl的染色工作液加入通道内，将芯片放入温度为37℃的恒温箱中，孵育2 h。孵育结束后，使用PBS溶液轻柔冲洗通道，去除未与细胞结合的染色剂，重复3次，每次持续5 min。将处理好的芯片放置在荧光显微镜下进行观察并拍照记录（在490 nm的激发波长下观察呈现绿色荧光的活细胞，545 nm的激发波长下观察呈现红色荧光的死细胞）。

2.4肿瘤微环境表征

室温下用PBS轻柔冲洗芯片模型内的细胞5 min，重复3次；加入4%的多聚甲醛固定细胞，静置10 min。用PBS轻柔冲洗通道内的多聚甲醛5 min，重复3次；使用0.1% Triton X-100对细胞通透处理5 min，PBS洗涤细胞3次，每次5 min。室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭细胞内非特异性结构1 h，使用重组HIF-1α抗体（1∶500）4℃孵育过夜，孵育完成后，使用PBS去除芯片模型内残留一抗。采用含Alexa Fluor 488荧光基团的二抗（稀释比1∶1 000）室温避光孵育1 h，用PBS冲洗残留的二抗后，加入DAPI避光孵育3 min，再用PBS冲洗通道3次，置于荧光显微镜观察并拍照记录。

2.5   U251芯片模型的活性评价

分别取适量阳性药储备液，使用完全培养基分别稀释成浓度为2.5、5、10、20 μmol/L的DOC工作液和100、200、300、400 μmol/L的TMZ工作液。在芯片两侧培养基通道中分别加入20 μl药物工作液，24 h后采用Calcein AM/PI染色试剂盒评价阳性药在2D培养和3D培养条件下对芯片内细胞活力的影响。

2.6芯片模型内细胞凋亡实验

采用线粒体膜电位检测试剂盒考察不同浓度的阳性药物对芯片模型内细胞凋亡的影响。取20 μl的PBS加入培养基微通道，轻柔洗涤3次，每次间隔5 min。在避光条件下，将超纯水、JC-1、JC-1染色液以160∶1∶40（V/V/V）的比例配制JC-1染色工作液。向介质通道侧加入20 μl染色工作液，将芯片放入细胞培养箱中，孵育2 h。孵育结束后，使用PBS溶液冲洗通道，去除未结合的JC-1染料，重复3次，每次间隔5 min。将芯片放置在荧光显微镜下进行观察并拍照记录，在490 nm的激发波长下，可以观察到JC-1单体的荧光信号；525 nm的激发波长下，可以观察到JC-1聚合物的荧光信号。

2.7基于U251芯片模型的中药半枝莲药效评价

2.7.1半枝莲的提取

精密称取半枝莲药材细粉25 g（过5号筛），将其置于500 ml 75%乙醇中浸泡30 min，90℃加热回流2次，分别提取2 h和1 h。合并2次的提取液，减压浓缩，使用50%乙醇将浓缩液转移至50 ml的容量瓶中，定容至刻度，即得浓度为500 mg/ml（药材质量/ml）的提取物浓缩液，备用。

2.7.2细胞毒性实验

取200 μl过滤后的半枝莲提取浓缩液（500 mg/ml），加入DMEM完全培养基，混匀得10 mg/ml含药培养基溶液，依次稀释得8、6、4、2、1、0.5、0.25 mg/ml含药培养基溶液。

将细胞悬液按5 000个/孔接种到96孔板中，空白组不加细胞，置于培养箱孵育24 h，弃去各孔中的旧培养基，实验组各孔中分别加入含有不同浓度的半枝莲溶液0.25、0.5、1、2、4、6、8 mg/ml，每孔100 μl；对照组各孔中均只加入细胞培养液，每孔100 μl，每个组5个平行。培养箱孵育24 h后，向各组每孔中加入10 μl的CCK-8试剂，于培养箱中避光孵育1 h，酶标仪检测450 nm波长处各孔的A值。

2.7.3芯片模型内半枝莲的药效评价

模型内细胞活力评价：采用“2.7.2”项下毒性实验得到的浓度，模型内加入2 mg/ml半枝莲提取液培养24 h后，采用Calcein AM/PI染色试剂盒考察2D培养和3D培养条件下半枝莲提取液对模型内细胞活力的影响。

模型内细胞凋亡评价：模型内加入2 mg/ml半枝莲提取液培养24 h后，采用线粒体膜电位检测试剂盒考察2D培养和3D培养条件下半枝莲提取液对模型内细胞凋亡的影响。

2.8统计学处理

采用Image J软件计算荧光强度，GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，当P<0.05时，表示差异具有统计学意义。

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