利用微流控技术进行主动式细胞分选的方法

利用微流控技术进行主动式细胞分选的方法是在微流控装置上通过采集不同细胞所带有的特征信号,借助外力进行分选。

1.荧光激活细胞分类术分选法

荧光激活细胞分类术(fluorescence-activatedcellsorter,FACS)或流式细胞分析术由于其本身具有的灵敏度高、高通量、技术发展成熟等特点已经成为许多生物学家进行细胞分选的首选方法。FACS的原理是通过压力驱动和鞘液夹流等技术实现样品聚焦,使经特异性荧光染色的目标细胞所制成的单细胞悬液呈单粒子排列,进入检测区域,检测器按照其产生的散射光和激发荧光信号的不同进行识别与记录,进而据其特性施以外力操控,实现细胞分选[4]。通常,由带有荧光分子标记的特异性抗体来对细胞表面的标记物进行识别。自从Fu等[5]将FACS与微流控设备结合,用于分选细胞以来,各种驱动力与微流控–流式细胞仪的组合应运而生,包括流体力驱动[6]、电渗力驱动[7]、静电力驱动[8]、动电力驱动[9]、介电电泳驱动[10]等。Krivacic等[11]运用该技术,在微流控芯片上以3×104/s细胞的高速实现了对癌细胞高纯度分选。Cho等[12]也使用微流控–流式细胞仪成功实现了对人类哺乳动物细胞的高纯度富集与分选,富集浓度达到230倍。

在微流控芯片上运用FACS完成细胞分选的优势:(1)灵敏性高,能够在单个细胞水平上实现细胞的逐一分离;(2)精准度高,细胞逐个通过检测器后被精确分类而得以分选;(3)应用广泛,涉及的被分类物质种类广泛,可用于多种细胞的分选。但其缺陷在于:设备昂贵,微通道易阻塞,样品易污染,分离的连续性无法保证,在检测、分离过程中细胞受到的撞击力大,导致细胞最终的存活率不高。这些缺陷有待进一步研究与改善。

2.磁操控分选法

在微流控芯片上运用磁操控分选法进行细胞分选筛选简便易行,易于作为前处理部分集成再用于细胞分析的微流控芯片上。磁操控分选法的高特异性与高效性使其在细胞分选方面具有相当大的优势。免疫磁分选技术和高梯度磁分选技术是目前微流控芯片磁操控细胞分选主要应用的方法。

免疫磁分选技术

该技术中细胞的分选是基于目的细胞表面的独特抗原与免疫磁性微球(或免疫磁珠)上的特异性抗体通过抗原抗体反应结合,在外加磁场作用下,仅与免疫磁珠结合的目的细胞被滞留在磁场中,无法与免疫磁珠结合的成分则被滤去,从而达到分离靶细胞的目的。在微流控芯片上利用免疫磁分选技术所分离出的目的细胞可直接用于后续的分析与检测,从而简化了操作步骤,提高了效率,便于连续化、集成化、自动化的实现。Kim等[13]利用C2A蛋白标记的磁珠,在微流控芯片上运用免疫磁分选技术,成功地使细胞悬液中的Jurkat凋亡细胞获得高效分离。Forbes等[14]在微流控装置上运用免疫磁分选技术,实现了对磁标记乳腺癌mcf7细胞的高纯度分离,大大提高了临床诊断的准确性。

高梯度磁分选技术

20世纪60年代后期开始发展起来的高梯度磁分选技术(highgradient magneticseparation,HGMS),主要用于分离磁性极弱的微粒,例如直径在100nm以内的顺磁性或逆磁性微粒。高梯度磁分选系统通常由填充有易磁化超细金属丝的柱形过滤器和电磁场组成,金属丝在电磁场的作用下产生磁场梯度,使处于该区域的己被磁化了的目的微粒被梯度磁力吸引而固定,而样品中的其他非磁性成分则不会在该区域滞留,从而实现目的微粒的分选。Adams等[15]制作了一个微流控芯片连续高梯度磁泳分选器,运用高梯度磁分选技术实现了对目标细胞的的连续快速高纯度分离。夏恒[16]利用相关软件,通过仿真模拟,将微通道的构型做了优化与改进,在微流控装置上实现了磁泳连续高效细胞分选。

微流控芯片上的磁操控分选法具有如下优势:(1)分选速度快、效率高、重复性好;(2)操作简单、无需昂贵的仪器设备,便于实现高通量、自动化;(3)分离过程无毒无污染,并可同时产生富集、纯化效果;(4)被分离细胞的存活率高,且生物学性状与功能不受影响。但是,目的细胞上独特抗原的特异性抗体的筛选是该技术的重点与难点,是制约该技术推广使用的瓶颈。

3.双向电泳分选法

双向电泳(dielectrophoresis,DEP),又称介电电泳,是微流控芯片上较常采用的细胞分选法,该方法利用芯片上的交流电场将样品溶液中的目的细胞分离,可利用细胞大小不同,同时完成对细胞的浓缩、操控和分选,是一种高效率且高选择性的方法。其原理是细胞在高频电场作用下产生极化,因介电特性、电导率和形状不同,不同种类细胞感应出不同的偶电极,从而受到不同的介电力,致使它们以不同速率向电场的正极或负极定向移动,从而在电场中实现分离。Gascoyne等[17]使用双向电泳–场流分级(dielectrophoresis-field-flow-fractionation,DEP-FFF)技术成功的从患者血液中分离出了感染疟原虫后的病态红细胞。由于红细胞感染疟原虫后,细胞膜表面蛋白发生改变,因此病态细胞等电点与正常细胞存在差异,在正旋交流电的作用下,病态红细胞以异常的泳动速度在微通道分离腔中实现分选。Zhu等[18]采用双向电泳技术,在微流控芯片上实现了对直径在4~8μm的酵母细胞的连续高效分选。

在微流控芯片上利用双向电泳技术可对细胞直接进行无接触的选择性操控、定位与分选,无需特异性细胞标记或修饰,外围设备简单,操作简便。但是生物细胞在电场中存活率较低,且该方法特异性较差,对于介电特性、电导率、形状等性质相似的细胞无法实现精确分离。

4.光学镊子分选法

在微流控装置上运用光学镊子分选法操控细胞分离时,由于光独特的光学极化效应,无需接触待分离的细胞,因而避免了机械接触所造成的污染与损伤,大大提高了分选后细胞的存活率,该技术已受到越来越多研究者的关注。光学镊子分选法主要根据目的细胞的大小和折射指数,在光干涉测量模式下,激光聚集可形成光阱,微小物体受光压而被束缚在光阱处,移动光束使微小物体随光阱移动,借此可对目的细胞进行捕获与分选[19]。捕获束的控制位置位于两个单纤维之间的微球上,微球的位置决定两纤维间的耦合程度,并决定光在二者间是聚焦还是偏斜,进而将产生的光信号与微通道内的电解质颗粒偶联,最终通过电场梯度截获电解质颗粒而捕获靶细胞。Wang等[20]利用光学镊子分选技术,在微流控芯片上分别实现了对酵母细胞和人类胚胎干细胞的操控与分离。

虽然,该技术的效率与FACS等相比仍较低,但其优势在于灵敏度极高,即使细胞间相互作用后产生的形变极其微小也可改变光的状态,进而通过光信号实现细胞分选。Chiou等[21]对细胞间相互作用及聚焦激光束进行深入研究后,对微流控装置加以改进,从而实现了高通量进样,大大提高了分选效率。

5.超声波分选法

利用超声波辐射力对悬液中的粒子进行分离提取,已被广泛应用于传统的化学工程与材料科学领域。超声波分选技术是利用超声波辐射力所具有的空化效应、机械效应、热效应,以及超声空化过程中气泡的剧烈变化所产生的附加湍动效应、界面效应、聚能效应等,通过提高传质系数,增大介质分子的运动速度,增强介质的穿透力以强化分离过程[22]。由压电材料在微通道中引发的超声共振效应可以产生超声波辐射力,从而产生上述效应,当细胞以流体的形式在微通道内移动时,不同直径、密度、可压缩性的细胞在上述多种效应的作用下,会产生不同的迁移率,进而可根据通过检测窗的先后顺序,完成细胞在微流控芯片上的分选。Petersson等[23]利用该原理,在微流控芯片上以自由流体声波电泳的方式,完成了对直径在2~10μm之间的粒子的分选,并将该技术应用于医学领域,实现了对血液中红细胞、白细胞、血小板的连续高效分选。该技术在应用过程中,细胞于超声波辐射力的作用下能否存活成为许多研究者关注的问题。Evander等[24]研究了细胞在超声共振效应中所受到的力以及微通道中温度升高的幅度,实现了对神经干细胞的高存活率分离,得到的目的细胞在微通道中可以存活十五分钟以上。

该技术分选效率较高,无需复杂的大型设备,但对设备材质的要求较高,价格昂贵,对操作人员的专业素质要求也较为苛刻,不利于推广使用。