用于DNA分析的微流体
1.关于用于DNA分析的微流体的介绍
微流体为生物分析提供了许多优势：
1.整个生物过程集成并因此简化了最终用户
2.高通量，多重和高度平行的分析
3.由于反应时间较短和/或分离时间较短，分析速度更快
4.用于即时应用的便携式设备
5.试剂消耗低
6.每次分析降低全球成本
所有这些优点已被广泛用于细胞和分子生物学。本综述介绍了微流体在后一领域的主要应用及其众多的DNA分析技术。
2.微流体DNA提取和纯化
细胞裂解及其在微流体装置中的应用
细胞裂解可以通过几种方法完成：化学裂解，热裂解，超声裂解，电裂解，机械裂解。
化学裂解是最常见的实验室工作台方法，因为它易于使用而无需特定设备。
该方法可用于片上裂解，但试剂在芯片外储存，然后通过外部流动系统注入装置中以进行片上裂解，这使制造复杂化全集成的裂解系统。
热裂解是PCR实验室芯片装置的便利方法，因为裂解所需的热系统也可用于以下PCR步骤。实际上，先前已经开发了几种在芯片上集成这些热裂解和PCR步骤的系统。热裂解只是将细胞暴露在高温下。大多数时候，热电材料集成在芯片上。
来自Privorotskaya等，实验室芯片，2010
超声裂解在微流体装置中呈现的优点，以避免在脉冲模式的局部加热，从而保持蛋白质结构，同时使一个简单的积分（不像化学裂解）。
超声裂解使用超声波振荡细胞内的空洞，直到它们崩解。微流体装置主要使用集成的压电传感器来产生这种超声波。
电裂解使用高电场，其可破坏细胞膜并因此诱导其裂解。由于电极易于集成，电裂解是微流体装置中常用的技术。然而，该方法存在一些缺点，例如在高压下可能的水电解并因此形成气泡。有趣的是，电极也可用于细胞介电电泳以进行上游细胞分选。
来自Medimoon网站
机械裂解可以在微流体装置中以多种形式进行。可以在微通道内整合尖锐的微纳米物体以破坏细胞膜和裂解细胞。通过使用例如高压地震膜压缩细胞直至其裂解，也可以使用压力。也可以使用磁珠通过用旋转的外部磁体拍打来裂解细胞。在这里可以观察到，机械裂解需要非常特定的设置，这可能使它们在诸如芯片实验室系统之类的更完整的设备中的集成变得复杂。
从Quora网站
DNA纯化及其在微流体装置中的应用
大多数微流体DNA纯化技术已经适应了在提取柱中制备的宏观方法，并且在某些缓冲条件下（高度离子和具有适应的pH）使用DNA吸附在二氧化硅珠上。在该DNA吸附后，用洗脱缓冲液（例如水的低离子缓冲液）从二氧化硅颗粒中释放DNA。
因此，在微流体装置内，二氧化硅珠可以被机械障碍物或二氧化硅涂覆的磁珠阻挡，以便用磁铁容易地阻塞这些颗粒用于洗涤和洗脱阶段。
其他类型的官能化可用于磁珠（例如核苷酸）。
在毛细血管中使用压力驱动流动的等速电泳也可用于有效分离DNA。简而言之，等速电泳使用DNA之间的不同离子迁移率，“慢”和“快”电解质。必须选择电解质以使DNA具有中间DNA迁移率，并因此在施加电场时聚焦在界面处。甲压力驱动逆流可用于控制聚焦界面的位置。因此，可以容易地从粗制样品中提取DNA。
来自Standford微流体实验室网站
3.微流体DNA电泳
电泳是由均匀电场引起的带电粒子的位移。基本上，由于DNA由于其糖 - 磷酸骨架而带负电，因此它将在均匀电场的存在下向阳极电极迁移。具有较高分子量的DNA将较慢迁移，因此可以区分具有不同分子量的DNA。
电泳应用
与较低程度的PCR一样，DNA电泳分离具有许多应用。
其中一个主要应用是验证前一段中提到的PCR结果。DNA必须用嵌入剂如溴化乙锭或Sybr Green染色，然后在紫外光下观察。通过电泳分离，通过大小分离DNA并与校准的分子量梯进行比较以检查获得的分子量并将其与预期的PCR结果进行比较。即使分子量得到验证，分子序列也不会，这使得这种类型的检测不如荧光探针的qPCR特异性。
电泳也可用于分析通过限制酶切割的DNA分子。这些限制酶在特定的限制性位点切割DNA。然后可以通过电泳分离不同的DNA序列，并根据所用的设备从电泳底物中回收，以将它们用作质粒构建的DNA序列模板（例如，质粒是环状DNA，通常合成为克隆载体或用于蛋白质）生产）。
电泳也可用于DNA测序。该原则将在下一段中讨论。
用于电泳的微流体装置
电泳最初在凝胶中进行，主要在琼脂糖（对于较长的DNA）和聚丙烯酰胺（对于较短的DNA）中进行。这些凝胶是多孔的，这解释了它们根据DNA大小/分子量降低了DNA电泳迁移率。
然后将电泳适应于毛细管，其具有优于凝胶的若干优点。首先，它们能够使用更高的电压，从而减少分析时间。其次，由于它们具有大的表面积与体积比，它们有效地消散焦耳热，这对于不产生温度梯度以及因此可能干扰电泳效应的对流效应是重要的。电泳迁移率也取决于温度，因此温度梯度可能导致迁移区的迁移率和变形的空间依赖性。
随着微流体技术的出现，DNA电泳成为第一个集成在芯片上的分子过程。这种小型化使得能够进一步增加处理时间以实现电泳（例如，在几分钟内对数百个碱基进行测序），减少试剂消耗并在芯片上组装其他DNA处理步骤，如前所述。现在，用于DNA电泳的微装置分析已商业化。值得注意的是，压力控制也可以与电动力结合使用，以将DNA样品注入分离通道内。该技术能够避免具有不同电子迁移率的物种之间的注入差异。
电泳微芯片中的样品注入方法的实例。（a）浮动注射，（b）双T模式。改编自Dorfman等，Chemical Review，2012。关于这些注射方法的解释可以在这篇优秀的评论中找到。
4. DNA测序和微流体
测序是确定DNA序列的核苷酸顺序的分析。首次测序是基于Sanger方法开发的。简而言之， 桑格方法基于PCR方法，但是，代替仅使用常规脱氧核苷酸（dNTP，参见PCR段落），标记的双脱氧核苷酸（ddNTP）也以低得多的浓度添加。与dNTP不同，ddNTP缺失3'羟基，这意味着当它们在细长DNA链的末端添加时，不能继续伸长。因此，通过与所有不同类型的dNTP（A，T，C，G）和较少的ddNTP进行PCR反应，用不同荧光团标记的ddNTP，具有不同长度的DNA片段和对应于不同核苷酸末端的不同荧光团将是获得。然后通过电泳鉴别这些DNA片段，并且不同的荧光团将能够光学区分不同的碱基并因此对DNA进行测序。
桑格方法原理
微流体已被广泛用于改善Sanger测序，特别是因为改进电泳和其他测序步骤（DNA纯化和PCR）的整合（参见前面的段落）。下一代测序技术对应于能够实现高通量测序的技术，从而大大降低其成本和持续时间。所开发的系统使用全球微纳米技术，生物物理和生物化学技术而不是特别是微流体技术，即使毫无需毫安和微流体来容易地在消耗品内运输和交换试剂。
在最着名的新一代测序系统中，我们可以通过合成技术，生命技术和使用半导体技术的Ion Torrent命名Illumina及其测序，Pacific Bio使用零模式波导进行单分子实时测序，Roche及其454测序系统使用焦磷酸测序技术。
然而，微流体更直接地用于依赖最初基于微阵列的测序技术的其他系统中，即杂交测序。基本上，待鉴定的序列暴露于大量短标记探针（通常5至10个核苷酸），因此在洗去非杂交探针后光学检测它们的杂交。研究的序列或探针可以固定在微阵列上。
通过将不同的标记探针置于液滴中并将它们暴露于DNA序列，已经应用了相同的原理。然后通过扫描每个液滴?光学检测杂交。已经开发了微流体装置以自动制备测序文库，即随机片段化的DNA序列，然后将其用于以下测序步骤。用于自动化文库制备的装置现在也由测序公司商业化。
用于Sanger测序的微流体芯片实验室采集热循环，样品纯化和芯片电泳。来自Blazej等，PNAS，2006
5.关于用于DNA分析的微流体的结论
我们看到微流体技术在DNA分析中发现了许多重要且关键的应用。
由于DNA分析所需的复杂程序和较长的分析时间，微流体技术能够集成芯片上的所有不同步骤，并大大缩短分析时间。然而，这种技术仍然需要在分子生物学实验室中被广泛接受，因为与常规方法相比，其成本目前相对昂贵。因此，它现在更多地用于需要高通量分析或非常灵敏的分析的实验室。