目的基因的扩增：PCR原理与过程

一、聚合酶链式反应的基本过程

聚合酶链式反应（PCR）是通过PCR仪，模拟DNA半保留复制，从而体外快速扩增DNA的方式。

生物实验室要用到PCR的地方……简直数不胜数。比如扩基因、检测、吃螺师粉儿（什么鬼……）等等。

典型的PCR包括高温变性、低温退火、中温延伸三个步骤，通过将这一套过程不断循环，使DNA得以成百万倍的扩增。

当然这是典型的……不典型的PCR五花八门。

因此所谓的PCR仪，其实就是一套自动温控系统，早先人们做PCR都是用水浴锅来做，指甲盖大小的离心管，在三个锅子里来回倒来倒去，拼个手速，攒个人品，好不热闹。

这么想想，其实现在实验室还是蛮幸福的。

高温变性：所谓变性是95℃左右时DNA双链打开的过程，使之能够与引物结合，为下面的反应做准备。但是注意考点：这里的DNA不只是我们加进去的模板DNA，还包括扩增出来的DNA，体系里但凡是双链，高温都能给他打开了。这个过程大约需要5 min左右，再长就煮熟了。

低温退火：退火是个很亲切的词，这是我们做无机非金属里面的概念，不知道是哪位巨巨给引入了生物学。所谓退火就是适宜条件下冷却的过程，上面说到DNA高温变性，变性后的单链与引物通过碱基互补配对，再次形成局部双链。更准确的来讲应该叫复性，恢复双链的过程。

中温延伸：模板-引物接头之后，对你没看错，人家就叫接头，浓浓的社会气息。延伸就是在72℃、TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，以靶向序列为模板，碱基互补配对为原则，再次合成完整的双链DNA的过程。我们可以看到这里复制之后实际上有一条链是新合成的，另一条则是原先就存在的，因此说这叫半保留复制。

二、聚合酶链式反应的组成成分

1.模板（1 ng/μL）

模板DNA可以从各种生物组织中得到，通常浓度为1 ng/μL。浓度不是越高越好，浓度太高会导致大量的非特异性结合。

2.引物（10 μmol/L）

引物浓度通常是10 μmol/L。

引物浓度太低，产量较低；

引物浓度太高，引起错配、非特异性以及引物二聚体。

一般都是商用的合成好之后直接用就好。

听说西双版纳植物园早先的时候订个引物要花一个星期送到，也是十分艰苦了。

现在的公司一般次日达，甚至当天给你送到，绝不会耽误你的毕业。

上海生工貌似快要一统江湖了，给金维智打一波广告……

3.Taq酶（5 U/μL）

U是酶活力单位，定义为：25℃下（其它为最适条件），1分钟内能转化1 μmol底物的酶含量，或是转化底物中1 μmol有关基团的酶含量。

4.dNTP（2.5 mmol/L）

dNTP可与Mg²⁺结合，使游离的Mg²⁺浓度下降，从而影响DNA聚合酶的活性。

5.Buffer（含Mg²⁺）

Mg²⁺是DNA聚合酶的激活剂。

Mg²⁺浓度过低会使DNA聚合酶活性降低，PCR产量下降。

Mg²⁺浓度过高会使特异性降低。

三、聚合酶链式反应的体系

四、聚合酶链式反应的结果

琼脂糖凝胶电泳检测以大肠杆菌碱性磷酸酶（AKP）为例，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下。

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