癌症筛查方法简介
“在生活中,癌症能够消耗、吞噬我们的一切。它闯进我们的脑海,占据我们的记忆,渗透我们的每一次谈话、每一个想法。作为医生,如果我们发现自己沉浸于癌症之中,那么,我们的病人就会感到这种疾病几乎会吞噬掉他们的生活。”
——(美国)悉达多?穆克吉(SiddharthaMukherjee),《众病之王》作者
“健康真的很重要。在生死临界点的时候,你会发现,任何的加班,给自己太多的压力,买房买车的需求,这些都是浮云。如果有时间,好好陪陪你的孩子,把买车的钱给父母亲买双鞋子,不要拼命去换什么大房子,和相爱的人在一起,蜗居也温暖。”
——于娟,复旦大学讲师,2011年死于乳腺癌,33岁
“导致癌症最重要的因素是什么?基因?污染?饮食?抽烟?都不是,和癌症发生率最相关的因素是年龄!2013年中国第一次发表了《肿瘤年报》,从年报中可以清晰地看出两点:第一,无论男女,癌症发病率从40岁以后就是指数增长;第二,老年男性比女性得癌症概率高,主要原因是大量男性会得前列腺癌。”
——李治中,《癌症真相——医生也在读》作者
癌症筛查方法简介
在中国,大多数癌症患者都是身体出现了严重不适症状才去医院检查,很多都已经处于癌症中晚期阶段,错过了治疗的最佳时机,消耗巨大费用的同时却换来的仍然是非常低的五年癌症存活率。
在美国,患者通常在一般体检或平时就诊时,获得医生给予的癌症筛查建议。而在其他国家,例如荷兰和英国,筛查建议通常并非由常规的医疗服务机构提出。这些国家通过有组织的体系,与所有符合筛查建议条件的成年人联系,提醒他们按建议的间隔时间接受癌症筛查。该体系包含全面的数据收集和评估系统,可以提供反馈,以提高筛查质量并尽可能减少筛查过程中出现的问题。
2013年,中国首次推出健康体检基本项目专家共识,参考美国现行指南,对恶性肿瘤风险筛查提出了建议(见下图)。
以上是针对特定癌种,如肺癌、乳腺癌、宫颈癌、直结肠癌、胃癌、前列腺癌分别进行的筛查方法建议。目前市面上还有一些泛癌种的筛查方法,归结为五类:
1. 循环肿瘤细胞CTC
CTC简介:
1869年,澳大利亚籍医生Ashworth首次提出循环肿瘤细胞(CirculatingTumor Cell,简称CTC)的概念。1976年Nowell将CTC的定义修正为:来源于原发肿瘤或转移肿瘤,获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。目前CTC是指存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。
外周血循环系统中的肿瘤细胞十分稀少,据统计每克肿瘤组织每天大约只有1×106个细胞进入外周循环,而人类血液中有数百亿个白细胞,相当于106-107个
白细胞中仅含有 1个肿瘤细胞,常规的检测技术难以发现。如何从这些白细胞中识别、检测出CTC成为一个技术难题。目前主要是利用肿瘤细胞与血细胞表面抗原存在差异的原理,将特殊标记的肿瘤细胞特异性好的单抗结合到细胞上,再运用流式细胞仪或免疫磁珠技术进行循环肿瘤细胞的识别和分选。
CTC意义
大量研究表明,CTC以不同形态存在于肿瘤患者的外周血中,既有游离的单个CTC,也有聚集成团的细胞团。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变(EMT,EpithelialMesenchymalTransition),故CTC存在不同类型,包括上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞与间质细胞混合表型。通过鉴定CTC的不同类型,可辅助判断病人肿瘤的迁移能力;如广州益善生物CanPatrol分型检测技术可对CTCs进行分离、计数和鉴定,适用人群为肿瘤患者。
外周血中CTC的存在可作为肺癌、前列腺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤等肿瘤发生转移的预后监测指标,并且CTC的数量变化可作为肿瘤患者无进展生存期、总生存期的预后评估指标。如胰腺癌患者中,CTC检测阳性的无进展生存期和总生存期短于检测阴性的患者。美国临床肿瘤协会亦接受CTC可作为乳腺癌标志,这为肿瘤的诊断和疗效监测提供了新的方向。
有些学者认为CTC是肿瘤转移的种子,这种说法来自于以下认识:外周血中的CTC大部分进入凋亡途径,仅少数通过EMT(上皮-间质转变)形成循环肿瘤干细胞(circulating tumor stem cell,CTSC),这些细胞具有与干细胞相似的生物学特性,能够自我更新、不断的增殖分化、迁移和侵袭能力强,并能够在微环境适宜时形成转移灶。但循环肿瘤干细胞的标志目前尚无普遍共识。
另外,CTC计数、分型、单细胞测序用于健康人群的癌症筛查还未成熟。
CTC检测优势:
1)实时监测;
2)CTC单细胞分析单个细胞而非群体的状态,可捕捉肿瘤细胞异质性;
3)抽血即可,对患者无副作用;
CTC技术局限:
与外周血中大量的白细胞相比较,仅仅是外周血中的“稀有细胞”,数量极少,约为1/10^7-1/10^6,这就使得分离获得的准确计数及其遗传信息检测变得十分困难。
目前,完整的检测通常需要分离富集和鉴定两个连续的步骤才能完成。通常采用鉴别表面标记的方法进行分离鉴定,但由于各肿瘤尚未发现表达的特异性抗原,且肿瘤细胞多为上皮细胞来源,因此分离鉴定的抗原多为上皮细胞抗原,如上皮特异性粘附分子、细胞角蛋白等。但在炎症、组织损伤、外科手术或者良性上皮增生性疾病等情况下,外周血中非肿瘤细胞的循环上皮细胞可导致检测结果出现假阳性。此外,在肿瘤细胞浸润侵袭转移过程中可发生上皮间质转化,使得细胞表面的上皮性标志抗原发生不同程度的改变,从而导致单纯免疫荧光化学染色方法分离鉴定存在一定的假阴性。?
2.ctDNA基因检测
ctDNA简介
循环肿瘤DNA(circulatingtumour DNA,ct DNA)是肿瘤细胞在坏死、凋亡后释放的一种游离DNA,由于其在血液中循环,所以对ctDNA的检测可以及时反映肿瘤状态。
ctDNA基因检测应用
ctDNA检测已应用于肿瘤的早期诊断、靶向治疗和预后判断等方面,由于高度特异性及灵敏性的新技术不断出现,检测ctDNA可作为一种"液体活检",具有很好的临床应用前景。
现有产品面向人群是癌症患者,市面上部分产品如下:
1)泛明安无创基因检测
所属公司:泛生子
灵敏度:万分之一
目标人群:初诊癌症患者、耐药及复发癌症患者
对病人的意义:用药指导、耐药监测
2)昂科益无创基因检测
所属公司:贝瑞和康
灵敏度:万分之三
目标人群:肿瘤患者
对病人的意义:靶向用药、动态疗效监测
3)Oncomine
cfDNA Assay
所属公司:赛默飞
目标人群:肺癌、结直肠癌、乳腺癌患者
对病人的意义:用药、复发监测
4)ctDNA无创个体化诊疗基因检测
所属公司:安诺优达
目标人群:
1)无法取得手术或穿刺组织的肿瘤患者;
2)治疗过程中出现耐药或治疗效果不佳的肿瘤患者;
3)已有组织切片,但储存时间超过1年的肿瘤患者。
产品总的来说,归为两类:
一类是针对特定癌种,基因更有针对性,造价低,1万以内;
一类是针对全癌种,基因更全面,造价较高,市面上价格1-几万不等;
产品选择需要根据癌种与需要检测的基因种类判断。
ctDNA优势
ctDNA技术用于肿瘤患者检测得到业内人士的广泛认可,其在操作方式上只需抽10毫升血,一次性检测多个基因,具备很好的便利性。
ctDNA技术局限:
化疗后取得的ctDNA很有可能化疗前的基因片段。不具备对疾病,如肿瘤负荷的实时反映。
另外,面对健康人群的早筛技术一直是基因检测公司发展的方向。其技术局限主要在于:健康人群ctDNA含量低,灵敏度受限;健康人群与肿瘤人群的基线难以确定。
3.遗传性肿瘤易感基因检测
遗传性肿瘤易感基因简介
据医学统计显示,肿瘤的发生并不是随机的,乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、大肠癌、胃癌等多种癌症都具有显著的家族聚集性,其中有5%-10%的肿瘤具有明确的遗传性。如果家族近亲中有两人以上患有癌症,那么其余家族成员罹患癌症的风险是比较高的。通过基因测序可以有效地检测出遗传性肿瘤相关的致病突变,从而预知特定肿瘤发生的风险,并进行有针对性的健康管理。
影星安吉丽娜茱莉因自己的母亲病逝于卵巢癌,选择了做基因检测查看自己患卵巢癌的概率,她选择的基因检测产品是美国基础医学公司FoundationMedicine的Foundation One。茱莉使用的FoundationOne报价5800美元,可以针对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌等所有实体瘤患者,该产品对单碱基替换、插入缺失、拷贝数变异及基因重排的检测灵敏度分别大于99%、97%、95%与90%,对基因组的平均覆盖度为500X。
茱莉检测的结果是她携带了卵巢癌与乳腺癌风险基因BRCA1的有害突变,从而使她患乳腺癌和卵巢癌的风险增大至87%和50%。根据检测结果,茱莉选择切除双乳与卵巢,至今身体健康。
其他遗传性癌症风险基因如下图所示:
遗传性肿瘤易感基因简介产品举例
1)泛生子139基因,包含上述所有基因。
2)赛默飞:BRCA1/2基因突变试剂盒,仅针对遗传性乳腺癌、遗传性卵巢癌
遗传性肿瘤易感基因检测优势
仅需提供个人血液或唾液,检出有患病风险后,可有针对性地制定预防计划。另一方面的优势在于一次性可检测多个基因。
遗传性肿瘤易感基因检测局限
局限一方面是检出阳性位点,可能无参考病例,造成结果无意义;另一方面是,结果仅仅是在癌症尚未发生的时候,判断是否有易感基因,预测未来患病的可能性。有业内人士认为,这种检测得出的“有 XX% 的几率患 XX 病”的结果实际意义不大,这一结果只能起辅助作用,作为诊断时的参考。
遗传性肿瘤易感基因检测,需要的时候,可以做一个。
4.肿瘤标志物
肿瘤标志物指恶性肿瘤细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质或是宿主对体内新生物反应而产生并进入到体液或组织中的物质;它们可以反映肿瘤存在和生长;包括蛋白质、激素、酶、多胺及癌基因产物等;主要来源于:1)分化紊乱的细胞基因产物(只存在于恶变的细胞中);2)肿瘤细胞坏死崩解释放进入血液循环的物质。
肿瘤特异生长因子(TSGF)
几种小分子的肿瘤标志物组合在一起合称为TSGF,它能促进肿瘤生长及其周边毛细血管大量增生,随着恶性肿瘤的形成和生长,逐渐释放到外周血液中。由于TSGF含量在肿瘤早期血清中即会明显升高,这一特性使其成为广谱恶性肿瘤早期辅助诊断的理想指标。通过TSGF检测可筛选出的不同瘤种、不同脏器的常见恶性肿瘤多达几十种,表明TSGF是恶性肿瘤的广谱标志。TSGF肿瘤特异生长因子测定是一种可以简便快速地用于恶性肿瘤早期辅助诊断的新型的肿瘤标志物,可用于人群健康防癌检查或高危人群筛查,通过定期检测,及早发现癌症,提高治疗效果。
其优点在于:
1) 广谱;
2) 癌症早期即升高;
3) 无需特殊设备,有成熟的试剂盒、无创伤性、操作简便、快速(1h即可出结果),而且持续阳性者或进行性阳性增高者,特异性高。
因此TSGF作为一种早期的恶性肿瘤标志物,其操作等特点,适宜各级医院测定。
缺点:
1)部分急性炎症(肝炎、肺炎等)、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿等病症可产生交叉反应,引起假阳性。晚期癌症患者TSGF含量可能低于临界值。
2)不能定位;
3)假阳性。
什么人做:
1)40岁以后体检
2)无明确原因迅速消瘦
3)有某些肿瘤家族史,具有家族性或遗传性肿瘤
其他肿瘤标志物
甲胎蛋白(AFP)
AFP是早期诊断原发性肝癌最敏感、最特异的指标,适用于大规模普查,如果成人血AFP值升高,则表示有患肝癌的可能。妇产科的生殖腺胚胎癌、卵巢内胚窦癌AFP也会明显升高。AFP中度升高也常见于酒精性肝硬化、急性肝炎以及HBsAg携带者。某些消化道癌也会出现AFP升高现象。孕妇血清或羊水AFP升高提示胎儿脊柱裂、无脑症、食管atresia或多胎,AFP降低(结合孕妇年龄)提示未出生的婴儿有Down’s综合征的危险性。
癌胚抗原(CEA)
CEA是一种重要的肿瘤相关抗原,在正常成人的血液中很难测出。70-90%的结肠腺癌患者CEA高度阳性,在其它恶性肿瘤中的阳性率顺序为胃癌(60-90%)、胰腺癌(70-80%)、小肠腺癌(60-83%)、肺癌(56-80%)、肝癌(62-75%)、乳腺癌(40-68%)、泌尿系癌肿(31-46%)。胃液(胃癌)、唾液(口腔癌、鼻咽癌)以及胸腹水(肺癌、肝癌)中CEA的阳性检测率更高,因为这些肿瘤“浸泡液”中的CEA可先于血中存在。CEA含量与肿瘤大小、有无转移存在一定关系,当发生肝转移时,CEA的升高尤为明显。
癌抗原125(CA125)
CA125迄今为止是用于卵巢癌的早期诊断、疗效观察、预后判断、监测复发及转移的最重要指标。CA125测定和盆腔检查的结合可提高试验的特异性。
各种恶性肿瘤引起的腹水中也可见CA125升高。CA125升高也可见于多种妇科良性疾病,如卵巢囊肿、子宫内膜病、宫颈炎及子宫肌瘤、胃肠道癌、肝硬化、肝炎等。
癌抗原15-3(CA15-3)
CA15-3是乳腺癌的最重要的特异性标志物。30%-50%的乳腺癌患者的CA15-3明显升高,其含量的变化与治疗效果密切相关,是乳腺癌患者诊断和监测术后复发、观察疗效的最佳指标。CA15-3动态测定有助于II期和III期乳腺癌病人治疗后复发的早期发现;当CA15-3大于100U/ml时,可认为有转移性病变。
肺癌、胃肠癌、卵巢癌及宫颈癌患者的血清CA15-3也可升高,应予以鉴别,特别要排除部分妊娠引起的含量升高。
癌抗原19-9(CA19-9)
CA19-9是胰腺癌,胃癌,结、直肠癌、胆囊癌的相关标志物,大量研究证明CA19-9浓度与这些肿瘤大小有关,是至今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。胃癌、结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌的阳性率也会很高,若同时检测CEA和AFP可进一步提高阳性检测率(对于胃癌,建议做CA72-4和CEA联合检测)。
胃肠道和肝的多种良性和炎症病变,如胰腺炎、轻微的胆汁郁积和黄疸,CA19-9浓度也可增高,但往往呈“一过性”,而且其浓度多低于120U/ml,必须加以鉴别。
癌抗原72-4(CA72-4)
CA72-4是目前诊断胃癌的最佳肿瘤标志物之一,对胃癌具有较高的特异性,其敏感性可达28-80%,若与CA19-9及CEA联合检测可以监测70%以上的胃癌。CA72-4水平与胃癌的分期有明显的相关性,一般在胃癌的Ⅲ-Ⅳ期增高,对伴有转移的胃癌病人,CA72-4的阳性率更远远高于非转移者。CA72-4最主要的优势是其对良性病变的鉴别诊断有极高的特异性,在众多的良性胃病患者中,其检出率仅0.7%。
CA72-4对其他胃肠道癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌也有不同程度的检出率。CA72-4与CA125联合检测,作为诊断原发性及复发性卵巢肿瘤的标志,特异性可达100%。
癌抗原242(CA242)
CA242是一种新的肿瘤相关抗原,当消化道发生肿瘤时,其含量升高。
癌抗原50(CA50)
CA50是胰腺和结、直肠癌的标志物,是最常用的糖类抗原肿瘤标志物,因其广泛存在胰腺、胆囊、肝、胃、结直肠、膀胱、子宫,它的肿瘤识别谱比CA19-9广,因此它又是一种普遍的肿瘤标志相关抗原,而不是特指某个器官的肿瘤标志物。CA50在多种恶性肿瘤中可检出不同的阳性率,对胰腺癌和胆囊癌的阳性检出率居首位,占94.4%;其它依次为肝癌(88%)、卵巢与子宫癌(88%)和恶性胸水(80%)等。可用于胰腺癌、胆囊癌等肿瘤的早期诊断,对肝癌、胃癌、结直肠癌及卵巢肿瘤诊断亦有较高价值。
非小细胞肺癌相关抗原(CYFRA 21-1)
CYFRA21-1是非小细胞肺癌最有价值的血清肿瘤标志物,尤其对鳞状细胞癌患者的早期诊断、疗效观察、预后监测有重要意义。CYFRA21-1也可用于监测横纹肌浸润性膀胱癌的病程,特别是对预计膀胱癌的复发具有较大价值。在疾病的发展过程中,CYFRA21-1值的变化常常早于临床症状和影像检查。
CYFRA21-1与良性肺部疾病(肺炎、结核、慢性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿)的鉴别特异性比较好。
小细胞肺癌相关抗原(神经元特异性烯醇化酶,NSE)
NSE被认为是监测小细胞肺癌的首选标志物,60-80%的小细胞肺癌患者NSE升高。
NSE也可作为神经母细胞瘤的标志物,对该病的早期诊断具有较高的临床应用价值。神经母细胞瘤患者的尿中NSE水平也有一定升高,治疗后血清NSE水平降至正常。血清NSE水平的测定对于神经母细胞瘤的监测疗效和预报复发均具有重要参考价值,比测定尿液中儿茶酚胺的代谢物更有意义。
另外对胺前体摄取脱羧细胞瘤、精原细胞瘤及其它脑肿瘤的诊断也有重要意义。
鳞状细胞癌抗原(SCC)
鳞状细胞癌抗原(SCC)是一种特异性很好而且是最早用于诊断鳞癌的肿瘤标志物。SCC在正常的鳞状上皮细胞中抑制细胞调亡和参与鳞状上皮层的分化,在肿瘤细胞中参与肿瘤的生长,它有助于所有鳞状上皮细胞起源癌的诊断和监测,例如:子宫颈癌、肺癌(非小细胞肺癌)、头颈部癌、食管癌、鼻咽癌以及外阴部鳞状细胞癌等。
总前列腺特异性抗原(Total PSA)
PSA是前列腺癌的特异性标志物,也是目前公认的唯一具有器官特异性肿瘤标志物。血清TPSA升高一般提示前列腺存在病变(前列腺炎、良性增生或癌症)。血清PSA是检测和早期发现前列腺癌最重要的指标之一,前列腺癌的诊断特异性达90%-97%。TPSA也可用于高危人群前列腺癌的筛选与早期诊断,是第一个由美国癌症协会推荐用于筛查50岁以上男性前列腺癌的肿瘤标志物。
游离前列腺特异性抗原(Free PSA)
单项的血清总PSA(TPSA)测定不能明确鉴别前列腺癌和良性的前列腺增生,主要是因为在浓度2-20ng/ml范围内,二组病人有交叉。而FPSA/TPSA不受此因素及年龄的影响,通过FPSA/TPSA比值达到鉴别前列腺癌或良性的前列腺增生的目的。前列腺癌患者的FPSA/TPSA比值明显偏低,良性的前列腺增生患者的FPSA/TPSA比值显著增高。优于TPSA单独测定。
β2-微球蛋白(β2-MG)
β2-MG是恶性肿瘤的辅助标志物,也是一些肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原。在恶性血液病或其它实质性癌瘤中,突变细胞合成和分泌β2-MG,可使病人血清中浓度显著上升,在淋巴系统肿瘤如慢性淋巴细胞白血病、淋巴细胞肉瘤、多发性骨髓瘤等中尤为明显,在肺癌、乳腺癌、胃肠道癌及子宫颈癌等中也可见增高。由于在肿瘤早期,血清β2-MG可明显高于正常值,故有助于鉴别良、恶性肿瘤。
以上各血清肿瘤标志物总结如下:
指征 | 肿瘤标志物 | ||||||||||||
AFP | CA 125 | CA 15-3 | CA 19-9 | CA 72-4 | CEA | CYFRA 21-1 | 铁蛋白 | HCG | β2微球蛋白 | NSE | Free PSA | Total PSA | |
胆管癌 | 1 | ||||||||||||
膀胱癌 | 1 | ||||||||||||
乳腺癌 | 1 | 1 | |||||||||||
C细胞癌 | 2 | ||||||||||||
宫颈癌 | 1 | ||||||||||||
绒毛膜癌 | 1 | ||||||||||||
肠癌 | 2 | 1 | |||||||||||
耳鼻喉部癌症 | 2 | 2 | |||||||||||
食道癌 | 1 | 2 | |||||||||||
生殖细胞癌 | 1 | 1 | |||||||||||
肝癌 | 1 | ||||||||||||
小细胞肺癌 | 2 | 1 | |||||||||||
非小细胞肺癌 | 2 | 1 | |||||||||||
淋巴瘤 | 1 | ||||||||||||
恶性黑色素瘤 | |||||||||||||
卵巢癌 | 1 | 2 | |||||||||||
胰腺癌 | 1 | 2 | |||||||||||
前列腺癌 | 2 | 1 | |||||||||||
胃癌 | 3 | 1 | 2 | ||||||||||
甲状腺癌 | 2 | ||||||||||||
贫血相关肿瘤 | 1 |
以上表格来自罗氏诊断网站,1:一级标志物:对决策有重要指导意义;2:二级标志物:结合首选方案,能起到帮助;3:三级标志物:结合其它诊断措施,能起到帮助
关于这些肿瘤标志物,慈铭体检相关产品如下:
男性肿瘤10项:CEA、AFP、CA19-9、T-PSA、F-PSA、F-PSA/T-PSA、CA242、CA724、NSE、Cyfra21-1、SCC
女性肿瘤10项:CEA、AFP、CA19-9、CA125、CA15-3、CA242、CA724、NSE、Cyfra21-1
5.PET/PET-CT/PET-MRI
PET:
PET名为正电子发生计算机断层显像,它的原理是能够显示出身体内某种同位素,其缺点如下:
1)需要向身体内注射含有放射性的物质;
2)假阴性、假阳性。
PET-CT:
PET-CT全称为正电子发射计算机断层成像/X线计算器断层显像(positron emission tomography- computed tomography, PET-CT),是利用正电子发射体标记的葡萄糖、氨基酸、胆碱、胸腺嘧啶及血流显像剂等药物为示踪剂,以解剖图像方式、从分子水平显示机体及病灶组织细胞的代谢、功能、血流、细胞增殖和受体分布善,为临床提供更多的生理和病理方面的诊断信息,因此也称之为分子显像。
PET-CT比单独采用 PET 或CT 的准确性更高,尤其在肿瘤分期方面。
但PET-CT除具有上述PET缺点外,还有如下缺点:
PET-CT在发现空腔脏器(胃、肠等)病变方面存在盲区。
PET-MRI
MRI中文为核磁共振成像。PET-MRI与PET-CT相比,有如下优点:
MRI不会产生射线辐射,病人检查安全性好;MRI可用于功能性检查如血管造影,功能MRI、弥散及灌注显像等
缺点:PET与MRI系统互相影响;成本昂贵。
总结
肿瘤的筛查是一项复杂的系统工程,目前在国内,无论是肿瘤检测技术,还是癌症筛查整个行业,都远未成熟。
另外,检测方法因人而异、因“癌”而异,因此在筛查时不仅要结合多种检测的结果,还要考虑多种综合因素,才能筛选出易患某种癌症的高危人群,进行进一步有针对性的检测。
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(文章来源: 基因前沿 作者:终身学习者 转载仅供参考学习及传递有用信息,版权归原作者所有,如侵犯权益,请联系删除)
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