灌流细胞培养及稳态操作

N-阶段灌流细胞培养

在生产生物反应器中，即通常所指的N-阶段生物反应器，细胞培养可在开始阶段快速达到超过系统容量的生物质水平，但由于营养或设备限制，细胞活性会快速降低。为防止这一情况的发生，可通过控制细胞密度的方法，在更长的生产期内，维持生物质恒定。当同时考虑N-1和N阶段时，可采用不同的策略，批次、补料分批和灌流模式可通过不同的方式而被改变。参考原文介绍了最近的一些关于在合理的更长时间的高密度灌流细胞培养中、使用不同的方法来控制并维持稳态的案例。

N-1和生产（N-阶段）生物反应器不同操作策略的示意图（A）N-1批次 & 生产生物反应器补料分批（B）N-1灌流 & 生产生物反应器高密度接种补料分批（C）N-1批次 & 生产阶段开始灌流，以快速提高生物质，之后补料分批操作（D）N-1批次 & 生产生物反应器灌流，并控制细胞密度。箭头指示在不同案例中使用灌流技术的优势：可用于接种的更高的生物质、更短的生产时间（B）；生产阶段更高的生物质（C）；生产阶段更高的生物质以及更长的运行时间(J.Bielser，et al., 2018)。

半连续和连续废弃分别根据每日离线细胞计数或在线生物质传感器监测结果进行。每日废弃会导致一种不连续的“锯齿状”行为，在两个相邻的废弃点之间，细胞密度连续增加，而在废弃点显著下降，这种方法可以在没有在线监测和控制使用。另一种替代方法是，根据细胞计数，每日调节连续废弃，可获得更加稳定的反应器行为，这种策略与半连续方法的区别在于连续的细胞去除，但细胞生产在某一时间点，还是会发生偏差。所以，最应选择的方法是使用在线生物质传感器，将其检测值与废弃流速直接耦连，以维持预先确定的设定值。

Dowd等使用声学过滤器和0.05 - 0.4 nL/cell/day的CSPR，维持~50 x 10^6 cells/mL活细胞密度的稳态操作5天。Clincke等报导使用TFF，以~1.44VVD的灌流速率，达到20 - 35 x 10^6 cells/mL的活细胞密度。使用ATF，以4.5 - 5 vvd-1的灌流速率，维持90 - 130 x 10^6 cells/mL的活细胞密度2周。Karst等报导使用ATF和TFF，将活细胞密度维持在20、60和40 x 10^6 cells/mL，稳态操作10天，灌流速率在1.06 - 1.44 vvd-1之间。根据目标灌流速率，使用不同百分比的高浓度补液对化学限定培养基进行富集。Warikoo等报导了50 - 60 x 10^6 cells/mL的活细胞密度稳态操作维持约50天，以及使用ATF和0.04 - 0.05 nL/cell/day的CSPR进行活细胞密度50 x 10^6 cells/mL（CHO，rhenzyme）的操作。Xu等报导了细胞密度分别在42和68 x 10^6 cells/mL的稳态操作，使用手动细胞废弃，最低CSPR为15和23 pL/cell/day。

CHO细胞灌流培养生物反应器稳态操作条件示例(J.Bielser，et al., 2018)。

使用非常相似的培养基比较不同工艺的性能，Xu等对各自产率进行了“公平”的比较，包括批次、补料分批（高或低密度接种）、浓缩补料分批以及灌流工艺。结果发现，所有生产模式中的细胞特异性产率范围相似，所以反应器最终的单位体积产率取决于工艺所能达到的细胞密度。对于灌流、高接种密度以及补料分批，观察到的产率值分别为2.29g/L/day、2.04g/L/day以及0.39-0.49g/L/day，这说明连续工艺可显著强化工艺。

稳态或稳定操作

下图所绘的设置包含了在线监测和废弃率的控制，可实现在稳定细胞密度条件下的连续操作。其结果是，生物反应器内的环境达到恒定状态，具有固定的生物质或细胞密度，即通常所指的稳态操作。按照其定义，在稳态下，没有产物积聚在系统内，进入（IN）、离开（OUT）反应器以及所生产/消耗的物质的总和为零。相应地，反应器内所有的浓度和物理参数随时间保持恒定，在一定程序上，必需是搅拌良好的罐，这些树脂在整个反应器体积范围内保持均一。

除了由化学反应或由于不同进/出液流而形成的成分的添加/去除外，在生物反应器内，还会发生其它一些过程，其与细胞生物学相关，且其动力学特性通常相对较慢。生物学反应速率不是恒定的，在工艺中，可能随时间发生变化。由于灌流操作的时间会延长到数天、数周甚至数月，这种缓慢的过程可能最终会形成不可忽略的成分，且在运行过程中导致缓慢的“漂移”。例如，由于某些类型的细胞衰老过程，细胞特异性产率会随时间降低。所以在描述灌流生物反应器时，“稳态”这个词的使用需要小心，而且需要记住的是，整体的系统总会缓慢地“漂离”初始描述的稳态。

稳态操作已被证实，如Karst等使用代谢组学技术，在不同的操作状态下观察了代谢物的浓度，如核苷酸、核糖和脂质前体。在以稳定操作3天后，可观察到代谢性稳态。有趣的是，在另一项研究显示在6至7天的过渡后细胞内过程才达到稳态条件，如糖基化。Bertrand等使用转录组学和蛋白组学研究了细胞内、外代谢物的动态过程，鉴定了3组转录物，第一组在3天后达到稳态（大部分）、第二组在7天后达到稳态（中间组）、最后一组没有达到稳态（小部分）。这说明，即使可以达到了稳定操作，即许多、甚至大部分代谢物达到了细胞内或外稳态，仍然会有部分生物学过程，在运行过程中会发生变化，但其可能只有极小的宏观影响。

另一个常用词是稳定操作，用于描述将关键工艺参数和质量属性维持在良好确定的范围内的操作。报导显示，一些较小的干扰可使系统偏离稳定操作设定点，但使用良好确定的控制策略，其可被快速校正，使对产物质量的影响最小化。这就是对“稳定”这个词的定义，指示了可提供具有在预先确定的界线或范围内的产物质量属性的反应器条件范围。

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参考原文：J.Bielser, M.Wolf, J.Souquet, et al., Perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing - A critical review. Biotechnology Advances, 2018, 36:1328-1340.

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