文献分享｜Nat. Biomed. Eng.｜惯性微流控芯片分离败血症患者外周血中的白细胞
大家好！为大家介绍一篇2019年发表在Nat. Biomed.Eng.上的文章，题目为“Leukocyte function assessed via serialmicrolitre sampling of peripheral blood from sepsis patients correlates with disease severity”。本文主要介绍了一种惯性微流控系统，用于从较少量败血症患者外周血中白细胞的分离和下游分析。通讯作者是来自哈佛大学医学院的Bruce D. Levy教授，研究兴趣是微流控方向的医疗设备开发与疾病诊断。
【背景介绍】
败血症引起的炎症性异常，是病原体感染致死的首要原因。在健康的患者中，中性粒细胞和单核细胞是该病症早期的应答者，在抵抗病原体、限制组织损伤、促进器官功能恢复和体内平衡等方面具有重要作用。一般情况下，监控败血症患者情况主要通过观察临床状况和外周血中白细胞计数，但该方法无法获得白细胞功能的相关信息，不能准确地评估疗效。此外，也可通过序贯器官衰竭估计评分（SOFA）评价败血症严重程度，但是该方法的误诊率较高（~30%），且无法提供病理学信息；或采用即时检测型微流控芯片检测循环细胞因子等，但依然无法有效地预测疾病的严重程度。由于白细胞必须结合各种不同的环境信号来做出保护型功能反应，它们的活性和功能可以作为疾病的细胞生物标志物。对白细胞的下游分析，可以为人类败血症和炎症性疾病的治疗提供新的策略。然而，频繁地进行全血细胞计数可能会导致患者贫血，尤其是重症患者。因此，开发样品需求量较少的白细胞分析检测方法具有重大意义。
【设计思路】
本文中所用无标记分离白细胞的惯性微流控系统如图1所示，全血用量为50 μL。所用微流控芯片为螺旋芯片，其特别之处在于其螺旋通道的横截面为梯形，如图1a中X和Y截面图所示。螺旋型流道的外侧部位（接至OW outlet）高于内侧部位（接至IW outlet），造成流道内外侧的流体线速度不同。稀释后的血样注入流道后，不同尺寸的细胞在迪恩曳力和惯性升力的共同作用下发生重排，尺寸较大的白细胞倾向于沿流道高度较小的流道内侧迁移，而尺寸较小的红细胞将沿流道外侧迁移，逐渐实现白细胞与红细胞的分离。从OW outlet流出的红细胞直接进入废液管中，而从IW outlet收集的白细胞，又再次反馈至样品管，重新进入螺旋芯片再次分离，直至获得较高纯度的白细胞。
图1 惯性微流控系统用于分离全血中的白细胞原理图，及其与密度梯度离心法分离效果的对比
【数据介绍】
1. 多型核中性粒细胞的分离及其在败血症患者和健康人中的作用作者首先测定了多型核中性粒细胞（PMN）表面的CD11b，CD66b和CD18的表达量，以评估惯性微流控芯片对PMN激活性质的影响。结果显示，惯性微流控芯片分离获得的PMN激活水平与处理前的细胞无显著差异，且均显著低于通过密度梯度离心法获得的PMN，表明惯性流微流控芯片比密度梯度离心法更适合用于分离全血中的白细胞。为研究经惯性流微流控芯片分离后的PMN的应激能力，以确定该微流控芯片对PMN活性的影响，作者分别测定了PMN的脱颗粒作用、NADPH氧化酶组装和吞噬溶酶体的形成。作者通过测定经十四烷酸佛波醇酯（PMA）刺激后的PMN中弹性蛋白酶释放水平，以评估PMN的脱颗粒作用，结果发现从健康人全血中获得的PMN经PMA刺激后弹性蛋白酶释放水平显著提高，且具有剂量依赖性（图2a）。此外，白三烯B4（LTB4）刺激也可显著提高PMN弹性蛋白酶的释放水平。进一步地，作者分析了败血症患者血液中获得的PMN的应激性。结果发现经LTB4刺激后，从败血症患者血液中分离的PMN弹性蛋白释放酶水平显著低于健康人的PMN。但经PMA刺激后，败血症患者和健康人PMN的弹性蛋白释放酶水平相当（图2b和c）。
2. PMN亚群的研究作者通过测定败血症患者和健康人血液中PMN表达CD16的情况，研究了PMN的亚群分布。结果发现败血症患者血液中CD16-和中表达CD16的PMN比例升高，而高表达CD16的PMN比例降低，且发现CD16-和中表达CD16的PMN比例与败血症的严重程度正相关，而高表达CD16的PMN比例与疾病严重程度负相关。
图2 中性粒细胞亚群（PWN）及其在败血症和健康患者中的作用
3.等介电法分离败血症患者和健康人血液中PMN等介电法（IDS）可测定PMN的等电位，以鉴别静息细胞和激活细胞。因此本文中采用IDS法分析了败血症患者和健康人血液中的PMN，以期通过IDS鉴别败血症患者和健康人。结果发现，败血症患者血液中未激活的PMN的等电位显著低于健康人血液中的PMN（图3c和d）。而经PMA激活后，健康人的PMN的等电位将降低至败血症患者的水平。进一步地，作者还发现，PMN的等电位与败血症严重程度负相关（图3f）。
图3 IDS法鉴定败血症患者和健康人血液中PMN的等电位
4.败血症患者和健康人血液中单核细胞亚群单核细胞在败血症发生过程的宿主反应中有重要作用。因此本文中还分离获得了单核细胞。经流式细胞术检测，确认惯性流微流控芯片对单核细胞在全部白细胞中的比例没有影响。随后，作者通过分析CD45+ FSC+ SSC?以及CD14和CD16水平，以研究单核细胞的亚群（图4a）。结果发现，败血症患者血液中中间单核细胞的比例显著高于健康人，而经典单核细胞比例却显著低于健康人，但两者的非经典单核细胞比例无显著差异（图4a和b）。进一步分析发现，经典单核细胞的比例与败血症严重程度呈反相关（图4c）。
图4 败血症患者和健康人血液中单核白细胞亚群分析
5.败血症患者的临床症状与白细胞参数的主成分分析作者利用主成分分析法分析了败血症患者血细胞（包括总白细胞、PMN、带细胞和单核白细胞）、临床疾病严重程度、白细胞表型亚群和白细胞功能的相关性。结果发现，利用血细胞参数无法区分败血症患者和健康人（图5a）；采用临床疾病严重程度指标综合评分，包括血压、人工呼吸需求、APACHE II和SOFA评分，确实可以区分败血症患者和健康人（图5c和d）。更重要的是，采用白细胞表型标志物的综合评分，不但能准确鉴别败血症患者和健康人，还能诊断败血症的患病时间（图5e~h）。此外，高表达CD16的PMN、经典单核细胞和白细胞和PMN功能性应激的综合评分，以及PMN功能性应激和等电位的综合评分，均可有效区分败血症患者和健康人。
图5 主成分分析用于研究败血症患者严重程度与白细胞参数相关性
【总结】
本文中开发了一种惯性微流控芯片平台，用于从微升级别的全血样品中，无标记地分离出白细胞。该方法具有所需样品量少、耗时短、对白细胞应激性能影响小等优势。进一步地，利用该芯片分离获得的白细胞（包括PMN和单核细胞），分析了白细胞数量、等电位、亚群占比等与败血症严重程度的相关性，发现采用白细胞表型标志物的综合评分，不但能准确鉴别败血症患者和健康人，还能诊断败血症的患病时间，为败血症的诊断和疗效评估、预后等提供了新方法。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-019-0473-5
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