几种获取单细胞的方法

单细胞测序已逐渐成为科研热点，它解决了用组织样本测序或样本少时无法解决的细胞异质性难题，为科学家研究解析单个细胞的行为、机制、与机体的关系等提供了新方向。但是单细胞测序遇到的第一个难题就是：“如何获取单细胞？”

1.有限稀释法（Limiting Dilution）

有限稀释法是根据细胞悬液浓度的计算，逐步稀释得到一定体积内只有1个或少量细胞的方法（一般为1 ul，多数WGA/WTA试剂盒可容纳投入体积）。

该方法操作简单，无需特殊设备。但是，由于分选基于浓度计算，无法直接观察，容易出现错误。

2.显微操作法（Micromanipulator）

显微操作法是将细胞悬液置于显微镜下进行单细胞挑选的方法，细胞挑选过程更直观。低配版显微操作，可以使用口吸管（英文名：Aspirator tube assembly）来进行；如果有经济实力的客户，可以使用显微操作台进行操作。首先，需要将细胞悬液进行稀释，浓度在20个细胞每微升为宜。吸取细胞时，毛细管内不能有太多的缓冲液，保证毛细管内液体在1ul左右。然后将毛细管内液体吹入反应管中，反应管中预先加入的4 ul裂解液，这一过程切忌产生气泡。

显微操作的优势在于能够准确地控制单细胞的吸取与释放；其缺点在于通量低，对操作人员的技术要求高。

3.荧光流式分选（FACS）

荧光流式分选能够很好的实现大量细胞的分选过程，并且能够做到精度高、通量大。但是它要求的细胞数量多，需要的样本初始体积较大，使一些小体积或微量样本 ( 如细针穿刺液 ) 分离单细胞受到了制约。该方法需要配备具有分选功能的流式细胞仪。在进行流式分选的过程中，需要先将样本制成细胞悬液。不同形式的样品，制作细胞悬液的方法也有所不同。

我们最为常见的样本类型有：新鲜实体组织、外周血单核细胞（PBMC）及培养细胞等。其中，新鲜实体组织需要经过酶解法、机械法或者化学处理法等方法进行细胞分散，制作细胞悬液。在制作细胞悬液的过程中需要注意：①无菌操作；②操作过程要迅速；③染色和固定避免对细胞产生伤害；④在分选前进行细胞计数和活性统计。

4.微流控技术（Microfluidics）

微流控技术可利用重力离心、流体力学、电场力等来捕获细胞，也可以通过流体力学利用细胞大小、细胞表面标志物等进行分选，同时可以整合细胞培养、细胞捕获分选、细胞裂解及后续的检测分析基于一体。可直观辨别目的细胞、实现高通量单细胞分离、自动化集成化。

5.激光显微切割技术（LCM）

对于切片组织样本，我们需要用到激光显微切割技术。该方法可直接观察分离样本，避免分离偏差；可以通过细胞形态观察，分离稀有细胞；同时可以了解到细胞的位置信息。但是，该方法也存在着分离通量低的缺陷，而且分离的过程中可能会破坏细胞的完整性。

在进行该方法的细胞分离时需要注意：①需要选择合适的细胞染料，避免染色过程中的RNA降解；②切片制作及细胞切割操作要尽量迅速；③分选下来的细胞附着在膜片上，可先将膜片上的核酸收集于大体积体系后再浓缩。

总之，细胞分选的方法多种多样。我们需要根据实验材料的特点、样本的细胞数量以及实验的设计思路等因素综合考虑，选择最合适的单细胞分选方法。