微流控芯片分选临床样品中循环肿瘤细胞的研究进展

癌症作为常见病正严重威胁着我国乃至全球居民的健康。循环肿瘤细胞（CTCs）是一类由癌变部位释放并进入血液中的癌细胞，其在癌症的早期诊断、个体化及肿瘤转移机制研究等方面的作用正逐渐被发现和认可，但由于血液中的CTCs含量极少，对其分选极具挑战。微流控芯片作为一种微型化、高通量、集成化平台，在CTCs研究中彰显了独特的优势，相关报道也越来越多。随着研究的深入，微流控芯片技术不再局限于基于模型样品的方法学开发，而是更注重于能否用于临床实际样品中CTCs的检测，但目前未见该角度的综述报道。为此，文章综述了近年来用于临床实际样品CTCs分析的微流控芯片分选技术，并探讨了微流控芯片用于CTCs分选的发展趋势。

随着人口老龄化进程的加快, 我国每年约有160万人新患癌症, 同时有约130万人因癌症死亡, 癌症作为常见的疾病已成为我国乃至全球居民的主要死因。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)的检测因在肿瘤早期诊断、治疗效果评估、肿瘤复发监测等方面彰显了巨大的潜力, 已引起广泛的关注, 并成为当前癌症研究的热点。1869年, Ashworth首先在血液中发现CTCs, 它是指从原发病灶或者转移灶脱落后进入外周循环血液系统的肿瘤细胞。CTCs最早出现于肿瘤早期阶段, 可以作为癌症早期筛查的项目。同时, CTCs被认为是肿瘤发生转移的必要前提, 它会对宿主组织器官产生威胁, 引起病变。研究表明约90%的癌症死亡案例与CTCs扩散有关, 因此CTCs能很好地反映肿瘤的恶性程度及转移能力等信息。由于CTCs在血液中含量极少, 每mL血液中约含有1~10个CTCs, 因此在血液中直接检测CTCs极具挑战。

20世纪90年代, Manz等提出了微流控芯片技术, 其是通过多学科交叉将化学、生物学、医学等领域所涉及的样品预处理、生化反应、分选及检测等过程集成到几平方厘米的芯片上, 从而实现从样品前处理到后续分析的微型化、自动化、集成化和便携化的技术。由于微流控芯片的通道在尺寸上与细胞相匹配, 在细胞分选上显示出了巨大的应用潜力。近些年来, 有越来越多的研究者将该技术应用到CTCs的分选上。根据分选原理, 微流控芯片有基于癌细胞与正常细胞或血细胞间生物学性质(包括细胞表面蛋白表达水平、细胞活性和侵润能力等)和它们之间物理性质(包括尺寸、密度、细胞表面电荷量和变形性等)差异的两大类CTCs分选方法。随着研究的深入和技术的成熟, 不断有研究者探索微流控芯片细胞分选方法在临床实际样品中的应用, 但目前未见从实际分选CTCs角度的文献综述报道。为此, 本文拟从化学和物理差异两方面综述微流控芯片CTCs分选法在临床样品中的研究进展。

1. 化学性质差异(亲和性分选)

亲和性分选是微流控芯片细胞分选中最经典的方法, 通过在芯片内部的微结构上固定能与目标细胞结合的特定的抗体或配体, 当样品流经微通道时, 固定在微通道中的抗体通过与细胞表面抗原特异性结合将CTCs捕获并保留在芯片内, 其他细胞随缓冲液流出芯片。常用的CTCs捕获抗体有人上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)和白细胞共同抗原CD45。亲和性分选包括两种捕获方式, 一种是直接特异性地捕获目标细胞, 称为阳性分选法; 另一种是捕获并弃除非目标细胞, 被称为阴性分选法。

1.1 阳性分选法

传统的亲和性分选方法是直接将抗体结合在微流控芯片通道内, 但由于样品在芯片中多处于层流状态, 只有贴近管壁的细胞可以和抗体接触从而被捕获, 分选效率相对较低。针对此问题, 学者们纷纷开发了多种适用于实际样品中CTCs检测的微流控芯片。

Nagrath等开发了一种名为“CTC-chip”的微柱阵列微流控芯片, 将抗-EpCAM抗体固定到微柱上, 此设计增大了细胞和抗体的接触面积。他们用此芯片对转移性肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌5种癌症共116例患者血样进行了检测, 在其中115例样品中成功检测到了CTCs, 检出率高达99%, 分选速度可达1~2 mL/h, 纯度约50%。同时, 他们在捕获的癌细胞中成功检测到了肿瘤标记物, 并通过DNA检测验证了实验结果, 结果表明此系统适合后续的分子分析。为了评估CTCs数量变化与肿瘤体积变化之间的关联性, 作者还测试了9例正接受治疗的3种癌症患者不同治疗时期的血样中CTCs的含量, 结合CT扫描结果所得皮尔森相关系数为0.68(P=0.03), 说明该方法在癌症治疗效果评估中也有一定的潜力。

Stott等设计了一种由78 000个结合有抗-EpCAM抗体的微柱组成的芯片, 并配有可以多个垂直焦平面分析、多个发射光谱信号量化的数字成像系统, 以实现CTCs快速准确的计数。该系统从19例前列腺肿瘤患者肿瘤切除术前血样中成功检测了8例, CTCs检测含量为38~222个/mL, 从36例转移性前列腺癌患者血样中检出23例, CTCs检出含量为14~5 000个/mL。

为了进一步增加癌细胞与微通道中捕获抗体的结合几率, Wang等设计了由两个功能部分组成的芯片, 第一功能部分是在芯片顶部嵌入锯齿状结构, 其可使样品呈涡旋式流经芯片顶部, 即当样品流经芯片内部时, 顶部的锯齿形结构可诱导水平流动的液体沿锯齿垂直流动, 增加CTCs与硅纳米粒子(silicon nanoparticles, SiNP)衬底之间的接触频率。另一功能部分是在芯片底部设计了涂覆抗-EpCAM的硅纳米柱结构, 该结构可增大细胞与捕获抗体的接触面积。他们用此芯片分析了26例处于不同癌症阶段的前列腺癌患者的外周血样, 分选速度为1 mL/h, 并将分析结果与CellSearch的分析结果对比, 发现:芯片处理1 mL样品时的捕获量与用美国食品药品监督管理局唯一认证的CellSearch的方法处理7.5 mL样品所获得的捕获量相当, 该结果证明了该芯片有更高的捕获效率。

同样基于增加捕获抗体与细胞的接触频率的思路, Lu等研发了一种名为NanoVelcro的芯片系统, 该芯片不同于Wang等的硅纳米柱设计, 其在芯片底部布满硅制纳米线以增加捕获抗体与CTCs的接触概率。该系统测试了40例前列腺癌症患者和12例健康志愿者的血样, 其中, 患者血液中CTCs的检出含量为1~99个CTCs/mL, 健康人血液中循环上皮细胞(circulating epithelial cells, CECs)的检出含量为0~2个CECs/mL, 分选速度为0.5~1 mL/h, 证明NanoVelcro芯片有强大的CTCs捕获效率, 可以有效避免CellSearch方法对大部分晚期前列腺癌症患者样品假阴性的问题。鉴于捕获的细胞均保有细胞活性, 如果芯片集成其他检测技术, 如基因组、转录和蛋白质组分析模块, 则可获得捕获细胞准确的分子信息。

在化学亲和分选方法中, 较高流速会影响抗原-抗体的吸附作用, 因此分选速度一般较低。为了提高芯片系统的分选速度, Hughes等将埃洛石纳米管集成在芯片内壁, 纳米管上固定有E-选择素和抗-EpCAM, 其中E-选择素可以捕获快速移动的CTCs, 而抗-EpCAM可以特异性的捕获CTCs。纳米管既可以保证分选效率, 又可提高分选速度(1~4 mL/h), 这是因为:1)纳米管涂层增加了捕获表面积, 使能结合到微通道中的捕获抗体大大增加; 2)纳米管由通道壁延伸到通道内部液体层, 该结构使得结合在其上的E-选择素的结合位点充分暴露在样品溶液中, 增大了捕获CTCs的概率; 3)纳米管能够抑制白细胞在微通道内壁的黏附[18], 提高了CTCs的捕获纯度。作者用此芯片分析了乳腺癌和肺癌转移患者的血样, CTCs的捕获纯度可达到50%以上, 且分选后的癌细胞在培养条件下可以维持细胞活性15天。

大多数亲和分选方法所用样品需要将红细胞裂解离心去除, 为了简化实验步骤, Stott等设计了一种鱼骨结构的亲和分选芯片可以直接分析全血样品, 如图 1a所示, 鱼骨结构中固定有捕获癌细胞的EpCAM, 鱼骨结构可将液体的流动状态从层流转变为涡流, 从而使细胞更容易与捕获抗体接触。该芯片易于操作, 通过集成多条微通道至芯片中形成平行阵列, 分选速度可达1 mL/h, 捕获的循环肿瘤细胞还可用于其他检测或细胞培养。Stott利用鱼骨芯片对15例男性前列腺癌症患者外周血进行分选试验, 结果显示该芯片在14例血样中成功捕获到了CTCs。此芯片还被用于36例转移性前列腺癌症患者血样中CTCs的检测, 成功检出了23例, 并通过基因测序成功检测到了捕获细胞裂解液中的TMPRSS2-ERG嵌合转录产物。此外, 在癌症患者血液分选过程中, 作者在芯片中观察到了细胞群, 这可能与癌症的转移过程相关, 而在模拟样品(即癌细胞与正常血液的混合样品)分析中未见此类现象报道, 这进一步表明模拟样品与真实样品存在一定的差异。

图 1 CTCs亲和分选装置(a)鱼骨结构微漩涡发生器、(b)抗体标记的磁性粒子捕获CTCs及(c)速度谷分选芯片、电化学裂解电极、纳米结构传感器的示意图

Sheng等对鱼骨结构进行了优化, 将宽度均一的鱼骨槽尺寸增大到80 μm甚至120 μm。在1 mL/min的通量下, CTCs的捕获效率提高到90%以上, 分选纯度大于84%。在18例胰腺癌患者血样中, 17例被检出CTCs, 在健康志愿者血样中未检测到CTCs。

众所周知, CTCs有诸多亚型细胞, 这进一步增加了CTCs分选的难度, 若将可与多种细胞表面抗原结合的抗体同时应用于CTCs分选中, 在理论上CTCs分选的灵敏度也会相应提高。Jackson等将与急性髓性白血病白细胞相关的3个细胞表面抗原(CD33、CD34、CD117)抗体分别固定在3张芯片上, 每个芯片包含50组宽25 μm的正弦型通道, 血液分别流经3张芯片时不同亚型的CTCs最大程度地被捕获。在25 μL/min的通量下, CTCs的捕获纯度为88%~99%。干细胞移植后的患者血样中CTCs监测结果显示, 此法适用于90%以上的患者, 不存在多参数流式细胞术采样频率低和适用比例(低于50%)低的问题。

上述固载了捕获抗体的微流控芯片技术都展示出了较好的CTCs捕获能力, 但在释放CTCs出微流控芯片以进行后续分析存在较大的困难。为此, 学者们将磁性材料引入到微流控芯片CTCs分选中, 它是将可与细胞表面抗原发生免疫反应的抗体结合到磁性材料上, 将其置于样品溶液中, 随后引入到微流控芯片中, 施加外界磁场, 捕获了CTCs细胞的磁性材料可被固定于微流控芯片中并与其他细胞分离, 撤去外界磁场后, 可将捕获细胞从微流控芯片中释放出来。

Earhart等在12 μm厚的软磁合金上制作了尺寸为40 μm×40 μm的微孔阵列, 整个芯片大小7 mm×7 mm (见图 1b)。血样首先与结合有抗-EpCAM的磁性纳米粒子混合孵育, 样品中的CTCs与磁性粒子结合, 当样品流经处于外界磁场中的微孔阵列时, 未结合细胞可穿过微孔, 而磁性纳米粒子标记的CTCs则被磁场捕获保留在芯片内部, 关闭外界磁场, 低流速缓冲液冲洗芯片即可收集捕获的CTCs。此芯片系统首先分析了肺癌细胞H1650和健康志愿者的全血混合样品, 在0.9 mL/min的流速下, CTCs的捕获率高达95.7%。随后, 此芯片又被用于测试6例非小细胞肺癌患者和5名健康志愿者的实际全血样品, 癌症患者组检测出CTCs含量为31~96个/mL, 在健康组仅检出一个CTCs。

Saliba等提出了一种利用Ephesia技术的细胞分选方法, 将生物功能化的超顺磁珠放置在微流控芯片通道中, 在适度的外场下(10~30 T), 偶极-偶极相互作用能克服磁珠的布朗运动并诱导磁珠链顺磁场方向形成。该系统包括一个底层的流体运输通道和一个上层的与流体运输通道交叉的夹管阀。通过控制流速和阀门的开合可以避免液流脉冲对于磁性柱阵列稳定性的不利影响。磁珠上结合的抗-CD19单抗可与B淋巴细胞特异性结合以达到分选的目的。作者用此芯片分析了4例慢性淋巴细胞白血病、1例套细胞淋巴瘤、2例滤泡性淋巴瘤共7例患者的血样, 在这些样品中均成功分选出CTCs。利用Ephesia技术中使用的功能化磁性珠可以批量生产, 因此成本大大降低。

Autebert等同样将Ephesia技术应用于CTCs分选中, 并用于上皮性癌症患者血样分析, 在8例前列腺癌和5例乳腺癌患者血样中分别检测出6例和4例, 实验结果和CellSearch相当。此外作者将血样进行梯度离心处理, 提高了分选纯度以便于下游分析。

在利用免疫磁分选的基础上, Mohamadi等利用速度谷芯片制作了一个集CTCs捕获、裂解、mRNA电化学传感检测于一体的分选系统(见图 1c)。芯片分为细胞捕获裂解和mRNA检测两大功能部分。在第一功能区域的速度谷芯片中, X型结构使通道中的流体产生速度差, CTCs会滞留在通道中液体流速小的位置, 同时EpCAM抗体功能化磁性纳米粒子可与CTCs特异性结合, 通过外加磁场即可实现对CTCs的捕获。通过在细胞捕获芯片区域的交叉电极上施加20 V电压可将细胞进行电化学裂解, 检测区域是由一系列标记有可与靶mRNA互补的中性肽核酸探针的纳米微电极组成, 裂解物转移到传感检测区后孵育30 min, 可检测细胞中前列腺特异性抗原的mRNA。通过对16例前列腺癌症患者和7例健康志愿者的血样测试及对细胞的免疫染色实验表明:癌症患者血样中CTCs的检出含量均在15个CTCs/mL以上, 而健康志愿者血样的检测浓度均低于15个CTCs/mL。该系统在2 mL全血中的CTCs捕获效率高达97%, 其富集效率可达500倍, 可将CellSearch分选CTCs纯度提升两个数量级。

Wang等设计了一种一步CTCs分选芯片, 该芯片可直接将CTCs从全血中分离出来。作者将免疫磁珠分离法和鱼骨结构的芯片结合, 标记有抗EpCAM和表皮生长因子受体抗体的磁珠首先与血样混合孵育, 当混合样品通过鱼骨结构的芯片时, 位于芯片上方的磁场可将CTCs捕获并保留在芯片中, 通过移除磁场可将CTCs回收并进行细胞培养及下游分子分析。此方法分选回收的CTCs具有较高的生物活性且能在较小体积的细胞培养环境中达到细胞增殖的浓度。在35例肺腺癌患者的血样中, 有5例成功实现了CTCs细胞增殖, 2例血样中的CTCs的培养时间可达6个月以上。

Tang等设计了一种操作简便的免疫磁珠CTCs分选方法, 其在分选装置中加入了包被在聚二甲基硅氧烷芯片中的镍点阵列, 镍点尺寸为50 μm×50 μm, 两个相邻镍点的纵向间距为100 μm, 横向间距为50 μm, 镍点可以增强磁性粒子局部磁场且可调节磁场分布(调节精度可到微米级), 结合有抗-EpCAM抗体的磁性纳米粒子在外加磁场的作用下会在芯片内部形成均一的磁性层, 便于CTCs捕获。细胞的回收及磁性粒子的解离仅需磷酸缓冲盐冲洗几分钟, 此法操作简单且能保持细胞活性, 被作者成功用于癌症患者血样中CTCs分选。

光化学也可被用于免疫磁力分选CTCs中, Lv等将具有光敏特性的7-氨基香豆素作为连接抗-EpCAM抗体和磁性粒子的桥梁, 免疫磁性粒子捕获CTCs后, 通过光照射可使7-氨基香豆素与磁性粒子解离以释放CTCs, 此法避免了磁性粒子对回收CTCs细胞培养的影响。在癌细胞系与人血的混合样品测试实验中, 该系统的CTCs分选效率可达90%, 纯度约为85%。在紫外照射下, 有90%活细胞从芯片释放, 近红外光可到97%的释放率。13例癌症患者(肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌)血样中均检测到了CTCs, 而在8例健康志愿者血样中未检出CTCs。

1.2 阴性分选法

肿瘤细胞转移过程会引起EpCAM表达水平显著性降低甚至丧失, 因此基于EpCAM的亲和分选方法无法应用到EpCAM弱表达或者不表达的CTCs分选中。同时, 阳性分选方法也存在一些问题, 如由于癌细胞亚群不同导致的CTCs检出量低、捕获的癌细胞不易回收或在回收过程中细胞活性易受影响。

针对这些问题, 研究者们开发了多种不同的阴性分选方法。例如, Lee等设计了一种叫“μ-MixMACS”的芯片, 此芯片包括两个功能模块, 分别是多涡旋混合模块和磁力细胞分选模块。首先使用溶血缓冲液去除血样中的红细胞, 然后样品在有多个弧形通道的芯片中与标记有抗-CD45抗体的磁性纳米粒子充分混合, 样品中的白细胞与抗-CD45抗体特异性结合, 当外界加入磁场时, 白细胞保留在芯片中, 而其他的细胞会随缓冲液流出而被收集。在10例乳腺癌患者血样检测实验中, 该系统成功在5例样品中检出CTCs。“μ-MixMACS”芯片的分离过程无需长时间的孵育且能实现CTCs的连续分离, 此方法不受癌细胞表面抗体表达量和细胞亚型的影响从而使CTCs的检出量大大增加。因此, “μ-MixMACS”芯片可以用于收集各种类型CTCs。

Sajay等设计了一种两步阴性CTCs分选平台, 首先在磁场的作用下利用标记有抗-CD45抗体的磁性粒子除去血液中的白细胞, 然后样品流经9 μm的狭缝薄膜时尺寸较小的红细胞、血小板等细胞通过狭缝, 而尺寸较大的CTCs保留在芯片中。为了测试该系统在临床中应用的效果, 作者测试了12例非小细胞肺癌和3例结直肠癌患者的血液样品, 此系统成功检测到所有样品中的CTCs。此方法具有3方面优势:1)2 mL全血样品完成分析过程仅需60 min, 可以满足快速分析的要求; 2)无需离心去除白细胞或加入化学试剂除去红细胞, 免去了繁琐的样品前处理过程, 而且白细胞和CTCs的回收率均大于90%; 3)由于整个分析过程未加入化学试剂, 所以回收的细胞依旧保持生物活性, 可以进一步进行蛋白质或核酸内容物的分析。

2 物理性质差异

血细胞和癌细胞存在很大的物理性质差异, 如密度、大小、形状和变形性以及在流场中的力学特性等。根据其不同的物理特点, 通过设计不同的微结构单元可将CTCs从血液中分离出来, 常用的微结构包括微孔阵列、微过滤膜和微柱等。

基于物理性质差异的分选方法不依赖细胞表面标志物, 操作简单成本低, 且分选后收集的CTCs可以结合多种抗体进行标志物鉴别, 而且样品流速大能够实现高通量分选。但在尺寸上CTCs和白细胞有重叠, 分选后的细胞中可能混有白细胞, 而且在较大的机械力作用下, CTCs流经微孔或者滤网时容易破裂[36], 这会导致分离纯度和细胞活性降低。

2.1 尺寸差异和变形性差异

2010年, Tan等利用癌细胞和血细胞在尺寸和变形性上的差异设计了一种芯片分离平台, 芯片的过滤部分是由3根呈圆弧形排布的微柱组成的阵列, 微柱间间隙5 μm, 以保证只有尺寸较大的癌细胞不能通过, 且每个过滤单元捕获一个癌细胞, 既达到分离的目的又避免了CTCs堆积造成的堵塞。作者选用5组肺癌转移患者的血样对此装置进行了测试, 实验结果达到了100%的检测率和50%的捕获率, 平均分选纯度为83%。此装置的优点是样品不需要预处理而且完成细胞的分选仅需一步, 该系统可以直接回收活性癌细胞以便下游分析。

Lv等设计了一种具有高纯、高效优点的间距递减的CTCs分选芯片。该芯片由过滤和捕获两部分组成, 过滤部分由间距为50 μm的微柱阵列组成, 可以减少细胞堵塞; 捕获部分由间距从12 μm到4 μm递减的10列微柱组成, 尺寸较小且变形性高的血细胞可通过间距较小的微柱进入废液槽, 而尺寸较大的肿瘤细胞和部分白细胞则进入旁侧回收槽。该装置的CTCs的分选效率大于90%, 纯度约为90%。作者通过裂解将红细胞除去可以很大程度地提高分选速度并可以减轻细胞堵塞的影响。此芯片在取样的10例肝癌患者血样中均检测到CTCs。

聚对二甲苯(Parylene)是一种具有较好生物相容性的材料。2010年, Lin等[40]采用Parylene微孔薄膜设计了一种CTCs分选芯片, 为了比较此芯片与CellSearch在检测灵敏度上的差异, 作者将10个培养的癌细胞混入10 mL健康志愿者的血样中, 取7.5 mL作为分选样品, 每个装置测试5组样品, 其中, 该系统在5组样品中均至少检测到1个CTCs, 而CellSearch仅在3组样品中检测到CTCs。之后, 他们利用此装置和CellSearch分别测定57例癌症患者血液样品, 其中微孔薄膜分选系统可以确定的有51例, 而CellSearch仅能确定26例。由此可以看出微孔薄膜分选系统较CellSearch有更高的检测灵敏度, 且由于Parylene具有很好的透光性, 该系统可以实现在显微镜上直接观察芯片中的细胞。

2012年, Lim等同样利用癌细胞和血细胞在大小和变形性上的差异, 使用有105个密集孔阵列的硅材料快速分析了血液中的CTCs, 阵列中孔直径为10 μm, 孔间距为15 μm。在对人乳腺癌细胞(MCF-7)和人肝癌细胞(HepG2)与血液的混合样品测试时得到了大于80%的回收率, 为了进一步验证此芯片在实际样品测试中的可行性, 作者又用8例癌症患者的血样作为样品进行分析, 该芯片成功地检测到CTCs, 从进样到得到测试结果仅需要1.5 h。由于Lim将芯片嵌合入荧光显微镜中, 因此该芯片实现了集CTCs捕获、计数、鉴定、免疫荧光染色的一体化。

2013年, Hosokawa等依据细胞间尺寸的差异设计了特定的微腔大小和几何结构以分选CTCs。该系统的核心结构由104个直径为8~9 μm的微腔阵列组成, 样品通过蠕动泵进入芯片, 尺寸较小的血细胞通过微腔随缓冲液流出, 尺寸较大的肿瘤细胞则由于负压作用被固定在圆孔上。该芯片测试了8种癌细胞与健康人血液的混合样品, 其分离效率高达97%, 远远高于同一实验样本采用CellSearch系统的分选效率, 并且细胞活性不会被破坏。在临床试验中, 作者用微腔阵列和CellSearch两种方法分别对22例非小细胞肺癌和21例小细胞肺癌患者样品进行检测, 该系统的检出率高达77%和95%, 而CellSearch的检出率仅为32%和57%, 两者在7.5 mL血样中检出CTCs的量分别为2~2 329个和0~325个。实验结果表明微腔阵列分选芯片较CellSearch有更高的CTCs检测灵敏度。

分选芯片复杂的制作步骤和昂贵的制作成本限制了其在临床中的应用, 因此很有必要开发一种简单、可靠、价格低廉的芯片。Huang等[43]设计了一种基于细胞尺寸差异的过滤式分选芯片。该芯片由86对互相平行的主通道和旁通道组成, 主通道和旁通道中间隔有分离通道, 主通道宽50 μm, 深50 μm, 分离通道宽20 μm, 深2~8 μm。主通道的一端直接与进样口相连, 另一端则被封闭。细胞进入芯片主通道时, 尺寸较小的血细胞可以通过分离通道进入旁通道进而在废液池被收集, 而尺寸较大的癌细胞则被保留在主通道内。此芯片的制作非常简单, 仅需要将模塑成型的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)黏合在玻璃基片上, 在芯片的进样口连接一个注射泵即可。使用该芯片在60例肺癌患者血样中成功检出58例, CTCs平均检测含量为18.6个/mL。该芯片具有制作简单成本低、实验操作简单易行且结果真实可靠的优点。

Adams等将孔径为7 μm的CellSieveTM过滤芯片用于CTCs分选。如图 2所示, 一次性的CellSieveTM过滤芯片置于支撑槽中, 血样样品由装置上部加入并流经过滤芯片时尺寸较大的CTCs保留在芯片中, 其他细胞随缓冲液进入注射器中, 分选过程结束后将含有细胞废液的注射器换成装有磷酸盐缓冲液的注射器, 并将此装置反转, 手动将缓冲液推入支撑槽中即可实现CTCs回收。作者选用10例乳腺癌和6例前列腺癌患者血样进行测试, 此装置不仅可以成功分选出CTCs并且可以完成细胞原位鉴定及细胞回收相关实验。CellSieveTM过滤芯片无自发性荧光且有生物惰性, 因此可以实现捕获细胞的原位免疫荧光染色鉴别和细胞培养。此装置集CTCs捕获、培养、鉴定、多种分子水平分析于一体, 结构简单, 分选过程无需对血样进行前处理, 可以满足商业化、临床化的要求。

图 2 一次性Parsortix盒整体及截面结构示意图

Chudziak等将Parsortix系统的CTCs分选和血浆中游离循环DNA检测结合, 如图 2所示, 一次性的Parsortix芯片中有多个并列的宽度呈阶梯状递减的通道, 通道最窄处10 μm, 由于CTCs较大的尺寸及不易变形的特性, CTCs被保留在通道的最窄处, 通过反方向冲洗芯片即可回收CTCs, 离心获得血浆中的游离循环DNA由核酸检测试剂盒检测。将此方法与CellSearch方法同时对12例肺癌患者样品测试, 此方法在全部血样中均检测出CTCs, 而CellSearch检出10例。此方法的优势在于:分选系统适用于室温存放4天之久的全血样品而且将CTCs芯片分选与血浆中游离循环DNA检测结合, 获取的CTCs信息更加全面。

2.2 力学性质差异

惯性分选也被用于CTCs检测, 其原理是芯片中的粒子受到惯性迁移和弯流道中的二次流效应的影响, 在特定雷诺数条件下迁移至特定的平衡位置, 形成聚焦流动, 从而实现不同种类细胞的分选。通常惯性分选采用的流速较高, 雷诺数在100左右, 且分选通道可平行集成, 因而具有较高的通量。

Sollier等设计了一种具有8列并联管道, 每个管道含8个缩扩单元的高通量分选芯片, 其中压缩单元宽40 μm, 扩张储液槽宽480 μm、长720 μm。缩扩结构中的惯性升力和流道结构诱导产生的涡流将不同细胞置于不同的平衡位置, 直径较大的癌细胞受较大的梯度剪切升力远离管道中心, 保留在扩张储液槽中, 而直径较小的血细胞则留在主流体中随液体流出芯片, 通过减低流速削弱涡流的作用可收集保留在芯片中的CTCs。在4 mL/min的高通量下, 该芯片分离癌细胞和健康人血液混合样品的效率可达85%。同时, 作者用该系统检测了12例乳腺癌和小细胞肺癌病人的血液样本, 其中9例被成功检出。

Hyun等同样将缩扩结构用于细胞分选, 4组缩扩结构平行集成在一张芯片上, 通道中的收缩单元宽60 μm、长150 μm, 扩张单元宽300 μm、长300 μm, 通道深度为60 μm, 每组微通道末端有3个收集口, 位于通道中间的出口收集癌细胞, 两侧的出口收集白细胞等。在样品进口和收集口分别安装一个注射泵以使液体在微通道中连续且稳定的流动。为了避免在样品处理过程中产生的异质碎片堵塞通道, 作者在分离通道的前面加了一个过滤器, 过滤器的加入不仅可以除去样品中的碎片同时增加了芯片的使用寿命。他们分别分析了MCF-7与白细胞混合样品和MDA-MB-231与白细胞混合样品, 两种癌细胞分选率分别为94%和92%。该系统又被用于检测24例转移乳腺癌患者的血液样品, 其中有19例样品成功检测到了CTCs。为了鉴定回收的CTCs, 作者分别检测了癌症细胞特征蛋白和DNA, 发现细胞角蛋白阳性、细胞表面CD45阴性和DNA阳性, 结果表明此芯片可以成功地将CTCs和白细胞分离。但分离微通道的平行化集成导致出口太多, 不便于操作, 并且此方法每次取样量为7.5 mL, CTCs检出数量仅为0~21个, 该分选系统的检测灵敏度较低。

在螺旋通道内的细胞会受到惯性升力和Dean拽力的共同作用而聚焦在不同平衡位置, Warkiani等利用此原理设计了一种梯形截面螺旋通道芯片, 相对常见的矩形截面而言, 梯形截面能拉大平衡时尺寸不同细胞的距离, 在细胞分选纯度上更有优势, 此装置通量可达1.7 mL/min, CTCs回收率高于80%, 10例转移性乳腺癌和肺癌患者样品中均被检测到了CTCs, CTCs检出含量为3~125个/mL。

同样基于惯性分选原理, Khoo等设计了一种由3组并联螺旋通道组成的微流控芯片分选系统, 该系统实现了大于7.5 mL/min的超高速分选, 在56例乳腺癌和肺癌患者样品中均检测到了CTCs, 其中乳腺癌患者血样的CTCs检出含量为12~1 275个/mL, 乳腺癌患者血样的CTCs检出含量为10~1 535个/mL。但该法需要样品进行离心裂解除去血浆和红细胞等前处理, 操作过程繁琐且有可能导致CTCs的丢失。

3 多种技术结合

目前, 已经报道了多种技术相结合的分选方法, Chang等将免疫磁力分选技术和尺寸过滤技术相结合分选了CTCs, 如图 3a所示, 此系统由1张微孔直径为8 μm的芯片、2个分别位于芯片顶部和底部的磁铁组成。首先, 免疫磁性分选方法将CTCs与其他血细胞分离; 然后, 水平移动芯片顶部的磁力较弱的磁铁促使过量的磁性粒子从微孔流出, 从而获取纯CTCs。分析不同类型癌症样品时, 他们将多种结合有不同抗体的磁性粒子混合使用, 50例肺癌和腺癌患者血样中有49例被检出CTCs, 患者在治疗前后血样中CTCs数量的变化也被成功追踪, 结果表明:治疗前后CTCs的数量确有显著性差异, 可以作为治疗效果评估的手段。在保证分选效率和纯度的基础上, 该系统分选速度可达2 mL/min, 克服了亲和分选方法中速度低、CTCs不易洗脱或回收样品中磁性粒子难以去除及物理分选方法中回收CTCs纯度低的问题。

图 3 (a)尺寸过滤+免疫磁力分选[50]和(b)确定性侧向偏移+惯性+磁性分选多级分选结构

Ozkumur等开发的名为CTC-iChip的多级微流控芯片也被用于实际样品分析。该芯片分为3部分, 见图 3b。首先, 样品依据尺寸差异经流体动力学初选, 即全血和免疫磁珠混合样品通过间隔32 μm的微柱阵列时, 红细胞、血小板、血浆蛋白、游离磁珠和其他血液组分被丢弃并通过顶部出口流出。随后, 正弦型惯性微流道将白细胞和CTCs聚焦, 连接特定抗体的磁珠与相应的细胞结合。最后, 磁场力将连接磁珠的细胞与其他细胞分开, 在收集口处收集CTCs。该系统可以根据分选细胞类型的不同选择阳性或阴性分选模式, 分别适用于EpCAM高表达的上皮性癌细胞和EpCAM低水平表达的非上皮性癌细胞, CTC-iChip对EpCAM表达水平不同的癌细胞均有较好的捕获效率。在8 mL/h的分析速度下, 该芯片CTCs捕获率高达97%。作者用患者样品测试了该系统的阴性模式, 成功地在41例前列腺癌患者样品中检出37例。同法分析了10例转移性乳腺癌患者样品, 并对捕获的CTCs染色, 将其与处于乳腺癌早期的细胞进行对比, 发现分选获得的CTCs与之形态相似。实验结果表明:CTC-iChip是一种不完全依赖肿瘤细胞膜抗原的、无偏的、广泛适用的且高通量的分选系统。

4 结论与展望

微流控芯片具有体积小、通量高、操作简便、样品和试剂消耗量少、便于集成多种分析检测模块等优点, 使其在细胞分选方面具有一定的优势, 本文总结了近些年已经用于临床样品中CTCs分选捕获的微流控芯片系统, 可以看出这些方法均可分选实际样品中的CTCs, 具有较好的分选效率和收集纯度。免疫亲和性分选法具有特异性强和纯度高的优点, 以及分选速度慢、通量低、成本高的不足, 同时上皮间质转换的作用使得细胞表面抗体表达水平具有多变性[56, 57], 亲和性分选方法仅适用于特异性抗体高表达的癌细胞分选。基于物理差异的分选方法实验简单、易行, 不需加入抗原抗体等昂贵试剂, 成本低, 分选过程不会引起细胞表型变化, 分选出的CTCs可进行单细胞基因组测序、转录组测序等下游分析, 但该法CTCs检出量偏低, 这是由于CTCs会与白细胞黏附或相互作用, 同时因白细胞和CTCs存在一定程度的尺寸重合, 该法细胞分选纯度也较低。

微流控芯片在CTCs分选中也面临一些技术上的挑战, 如1)芯片通道空间小, 实验过程中通道容易堵塞; 2)芯片制作需要精密仪器, 故造价昂贵不利推广; 3)在进行细胞分选时, 有些方法难以确保较高的细胞活性。

尽管如此, 不断有新型微流控分选系统被成功应用到临床样品CTCs分选中。目前, 该技术发展趋势如下:

1)单一分选方法都存在不足, 同一块芯片上多种分选技术的融合互补将增加分析系统的鲁棒性;

2)细胞内分子分析和CTCs表征有助于临床上治疗方案的选择决策, 在芯片上集成样品预处理、CTCs分选、细胞计数、内容物分析等功能单元, 使CTCs分选集成化、一体化;

3)制备廉价、便携、易于床边实时监控诊断的多功能微流控芯片。随着技术的不断完善, 我们相信微流控技术在CTCs研究中将逐渐发挥更重要的作用。（文章来自：中国科学院大连化学物理研究所转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）

文献地址：http://www.chrom-china.com/fileup/HTML/sp1609005.htm