微流控分析芯片上生化反应技术研究进展_

微流控芯片上酶和免疫反应

1. 微流控芯片上非均相酶和免疫反应

芯片上酶和抗体的固定化就是通过化学或物理方法 ,使原来水溶性的酶或抗体与联结在微管道管壁的水不溶性固态支持物相结合或被载体包埋。固定方法有物理吸附、交联、共价结合及包埋法等。酶和抗体经固定化处理后一般稳定性有较大提高 ,可重复利用 ,分析成本降低 ,而且适于连续自动分析。与电极表面、孔板、磁性微珠、玻璃管等敞开体系中蛋白质固定不同,在微尺寸封闭体系的芯片微管道中固定酶或抗体,操作难度更大;而微流控芯片上酶和抗体的固定化对微管道的构型要求不高 ,往往直接采用常规的T型和Y型微管道。因此 ,研究的重点在于如何有效地实现酶和抗体的固定化 ,目前仅有为数不多的酶或抗体固定方法成功地转移到了微流控芯片上[13 ] 。

（1）马来酐衍生物或戊二醛固定酶

戊二醛或马来酐衍生物是研究得较为深入的酶 或抗体的交联剂。其中戊二醛处理过的载体具有醛 功能模板 ,与蛋白质分子发生不可逆共价结合 ,而马 来酐衍生物使蛋白质分子与载体以肽键方式结合。 Lee 等 [14 ]分别用这两种固定方法 ,将大豆过氧化物 酶(soybean peroxidase ,SBP) 固定在修饰的玻璃材质 T 型微管道表面 ,进行了对甲酚的双氧水酶催化氧化 反应 ,并同时固定脂肪酶ΠSBP ,实现了微流控芯片上 对甲苯基醋酸盐的多级酶催化氧化反应。也有报道 用 APTES (32aminopropyltriethoxysilane) [15 ] 对玻璃或 PDMS 管道表面进行氨基功能化处理 ,然后再通过 与羧基的共价结合来固定抗体。

（2）溶胶2凝胶固定化酶

溶胶2凝胶固定化酶是将酶分子固定在高聚物 格子里 ,这种固定化酶的机械强度较大 ,酶分子不易 脱落。Kato 等 [16 ]在标准 DNA 分析芯片的进样储液 池中制备猪胰岛素胶囊凝胶来固定胰蛋白酶 ,进行 了精氨酸乙酯和酪蛋白的水解及在线的荧光检测。 Jin 等 [17 ]利用凝胶微珠固定胰蛋白酶 ,进行酶的水 解及电泳分离和质谱检测。Huang 等 [18 ] 利用比表面 积较大的纳米粒子对 PMMA 管壁进行修饰后 ,通过 凝胶固定胰蛋白酶[19 ] 。

（3）微珠固定酶或抗体

磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属 氧化物的超细粉末而具有磁响应的高分子微球。它是近20年来发展起来的新型高分子材料 ,除了具有 纳米颗粒的特性外,还可以通过表面的官能团进行各种功能修饰,用来固定酶或抗体,而且表面具有磁性,在外加磁场的作用下可以进行分离,用于蛋白质的分离和纯化,因此在生物样品分析提纯和临床检验领域有着广泛的应用。目前在微流控芯片上微球主要是作为酶或抗体的载体,发展成熟的磁性微球或没有磁性的玻璃微球在微流控芯片上都有应用[20 —22] 。

磁性琼脂糖微珠被 Srinivasan 等 [23 ]用来在 PDMS 微管道内固定 Pikc 羟化酶 ,进行铁氧化还原蛋白催 化大环内脂化合物的羟化反应 ,70nlΠmin 流速的反 应产率可达 90 %。玻璃微珠经烷基氨修饰后可与 抗体通过戊二醛结合 , Tsukagoshi 等 [24 ] 利用这一方 法在电泳芯片样品储液池中固定抗人血清蛋白 ,进 行竞争免疫反应后 ,反应产物进行电泳分离和化学 发光检测。测得人血清白蛋白(HSA) 含量为319gΠL。 同样的方法 ,在玻璃珠表面固定羊抗人血清 (anti2 IAP) ,测得血清中癌症标记物 IAP 含量为 272mgΠL。

Sato 等 [25 ,26 ] 用聚苯乙烯微珠固定干扰素抗体 , 此系统的特点是采用反应管道中的坝式结构将微珠 固定(图 1) 。注入干扰素 (IFN) 进行免疫反应 ,再与 维生素 E 联结的羊抗2重组 IFN 多克隆抗体联结 ,用 胶状金粒标记后 ,进行产物的热透镜检测。芯片设 计为四通道 ,可以同时测定 4 个样品 ,4 个样品从反 应到分析总共需要 50min ,检测限达到0101ngΠml ,而 常规方法每个样品就要 35min。这种方法利用微流 控芯片的高通量及灵活的流体操作来处理酶联免疫 反应 ,可以大大节省检测时间及试剂消耗。Kim 等 [27 ]利用结合了抗体的顺磁性纳米颗粒与荧光标 记聚苯乙烯微珠通过抗原2抗体作用力发生吸附 ,在 外界磁场作用下分离 ,进行了兔和鼠免疫球蛋白的 测定。Luo 等 [28 ]将金纳米粒子作为抗原蛋白载体沉 积在 PDMS 管壁 ,进行了羊抗人 IgG的测定 ,检测灵 敏度达到 10 ngΠml。

图 1 非均相酶联免疫反应芯片[25 ,26 ]

Fig. 1 Microchip of inhomogeneous ELISA[25 ,26 ]

（4）硝化纤维膜固定酶

纤维素结构中存在大量羟基 ,可通过氧化、酯化、醚化和交联等各种反应进行功能化处理 ,用于酶 或抗体的固定。Park 研究组[29 ] 将市售硝化纤维膜 经过溶解再成型 ,通过不可逆疏水作用力将β2牛乳 糖与膜吸附固定 ,固定化的酶位于十字型电泳芯片 管道交叉口下游 (图 2) ,当样品流经酶固定床的时 候与之发生反应 ,然后产物进行电泳分离。进行了 FDG(fluorescein di2β2D2galactopyranoside) 的β2牛乳糖 降 解 反 应 和 FMG ( fluorescein mono2β2D2galact2 opyranoside) 与β2牛乳糖的酶反应动力学研究 ,测得 的 Km = 11217 ,与其他报道值 117 接近。

图 2 非均相衍生反应电泳芯片结构[29 ]

Fig. 2 Structures of CE2microchip for inhomogeneous reactions[29 ]

（5）原位聚合固定酶

Mersal 等 [30 ] 用硅烷化试剂 (γ2MAPS) 修饰玻璃 芯片微管道 ,在进样管道中通过原位聚合的方法制 作固定有葡萄糖氧化酶的聚酰胺整体柱 ,作为柱前 反应器 ,进行了果汁中葡萄糖的酶反应及电泳分离、 安培检测。这种固定化酶可以连续使用 8h 而不失 活。Qu 等 [31 ] 报道了在硅烷化试剂 (XPS) 修饰过的 PMMA 微管道中通过原位聚合的方法制作硅胶整体 柱来固定牛血清白蛋白 ,用作质谱检测的衍生处理芯片。

（6）其它固定方法

Phillips 等 [32 ,33 ] 用胶囊融合的方法在等离子体 氧化处理过的 PDMS 管壁上引入卵磷脂双分子层 膜 ,可以使表面的浸湿性大为改善。将霍乱病毒绑 定在膜上 ,然后与兔抗2霍乱病毒发生免疫反应 ,再 联结荧光标记的二抗后进行荧光检测。接触角测定 显示双分子层膜处理的 PDMS 管壁亲水表面可保持 几小时。Wells 等 [34 ]提出了一种新的 Y型微管道中 酶的固定方法 : 在压力驱动的微管道中施加与压力 梯度相反的电场 ,利用这种竞争作用力将靶蛋白β2 乳球蛋白捕获并固定在负极区域 ;然后依次注入 DDT(dithiothreitol) 分解二硫键 ,碘乙酰胺使巯基丙氨 酸烷烃化 ,胰岛素和蛋白质降解酶水解 ;多步反应后 反接电场 ,将产物冲出管道进行质谱检测 (图 3) 。 此外 ,还有报道利用高聚物管壁与蛋白质的非特异 性结合力固定葡萄糖氧化酶[35 ] ,两性磷脂聚合物或 多分子层膜固定胰蛋白酶[36 ,37 ] ,动态橡胶微珠固定 地高辛单克隆抗体[38 ] ,以及在 PDMS 聚合物材料里 面添加生物素2磷脂 ,用于固定链霉素[39 ] 。

图 3 电场固定化酶反应微流控芯片[34 ]

 Fig. 3 Enzyme solidification by electric field on microchip[34 ]

2.微流控芯片上均相酶和免疫反应

非均相酶和免疫反应虽然可以提高酶和抗体的 利用率 ,但是芯片上蛋白质的固定化难度较大 ,而且 固定化都会一定程度上改变酶或抗体的分子结构 , 影响其反应活性 ;而均相反应会大大提高分子的传 质能力 ,缩短生化反应的时间且没有复杂的蛋白质 固定化程序。微流控芯片超微量的样品消耗以及灵 活的流体操作也更适合于均相反应。因此 ,微流控 芯片上更适合于集成各种类型的均相生化反应过 程 ,其研究的重点在于如何通过合理微管道构型设 计进行反应液流的操纵。也有报道采用多相流或微 液滴技术进行酶反应[40 ,41 ] ,其液流控制技术难度较 大 ,目前来看 ,用于实际的样品分析尚需一定的时 间 ,本文对这部分内容不做详细介绍。

（1）微管道柱前反应

直接在离线的微反应管中进行酶或免疫反应 , 然后将反应产物转移到电泳芯片上进行电泳分离和 检测是芯片上生化反应集成的最初设想。TNT和单 · 228 · 化 　学 　进 　展 第 19 卷 克隆 TNT抗体及荧光素标记三硝基苯的竞争免疫 反应产物[42 ] ,以及重组破伤风毒素 C 片段(CTTC) 与 单克隆破伤风病毒 C 片段抗体 (anti2TTC) 及荧光标 记的牛血清白蛋白竞争免疫反应产物[43 ] 已经被成 功转移到电泳芯片上进行分离和检测。Caliper 公司 的Lin 等 [44 ]设计的芯片(图 4) 用来进行荧光标记底 物与磷酸脂酶的反应 (在孔板上进行) ,然后进行 MEKC分离 ,测定酶的活性 ,通过抑制剂滴定进行高 通量筛选。这种方法实际上并没有真正地将生化反 应集成到微流控芯片上 ,只是利用了电泳芯片的分 离功能 ;而且在反应产物由反应器转移至电泳芯片 的过程中势必造成试剂的损耗 ,这个不连续的过程 可能对最终的分析造成误差。

图 4 多通道电泳芯片[44 ]

Fig. 4 Multi2channel CE2microchip[44 ]

直接在电泳芯片样品贮液池中进行的酶和免疫 反应一定程度上避免了这个问题。利用这一设计方 法 ,Starkey 等 [45 ]在电泳芯片的样品储液池中进行β2 葡糖甘酸酶与荧光标记的单2β2D2葡萄糖甘酸反应 , 然后经电泳分离和荧光检测 ,进行酶的抑制分析。 Abad2Villar 等 [46 ]结合非接触式电导检测进行了人免 疫球蛋白 IgM 的直接免疫分析。Wang 等 [47 ] 使用普 通的十字型电泳芯片 ,在样品贮液池进行对氧磷、对 硫磷和甲基对硫磷的有机磷水解、酶降解反应生成 电化学活性的硝基酚磷酸酯 ,反应产物经电泳分离 和电导检测。他们还将葡萄糖氧化酶加入到缓冲液 中 [48 ] ,在分离管道中酶与葡萄糖发生反应生成葡萄 糖酸和 H2O2 ,实现了葡萄糖、尿酸、维生素 C 和对乙 酰氨基酚的同步检测。Schwarz[49 ] 在电泳运行缓冲 液中添加葡萄糖氧化酶 ,催化有机胺的循环氧化 ,增 强安培检测信号。这些在贮液池或分离管道中进行 的生化反应和后续的检测虽然是连续的 ,但这些反 应器都是非流动式的 ,没有任何流体的扰动 ,反应程 度也是不可控制的 ,反应物仅通过简单的分子扩散 混合 ,传质较慢 ,需要反应时间较长。但对某些酶和 免疫快反应 ,由于可以简化芯片设计 ,这种反应方法 也经常被人们采用。

设计柱端反应器是电泳芯片上酶和免疫反应最 常用也是最有效的手段。因为微流控芯片上灵活多 变的流路设计使得生化反应可控性更强 ,从反应尤 其是多步反应到分离检测一系列连续操作过程 ,大 大节省了分析时间 ,微尺寸的反应管道可节省昂贵 的生化试剂。因此 ,这一领域的研究相当活跃。柱 端反应管道设计的出发点是通过优化混合反应管道 的构型和尺寸使反应物充分混合 ,灵活的液流操作 保证反应程度的可控性以及多通道集成进行平行检 测 ,避免多次操作带来的偏差。

目前 ,芯片上柱前均相酶和免疫反应管道总体 上分为敞开式[50 ,51 ]和封闭式[52 ,53 ]两种。所谓敞开式 柱前反应器就是酶或免疫反应在芯片上的样品贮液 池中进行。但与上述非流动式反应器不同 ,各种反 应试剂是通过与样品池相连的试剂贮液池分别引入 的。这种反应器中分子的传质较慢 ,需要较长的停 留反应时间 ,而且敞开的反应器会造成试剂的挥发。 报道最多的是封闭式的反应管道。理论上 ,微混合 器的原理都适用于柱前反应器 ,但过于复杂的柱前 反应操作不利于后续的分离分析 ,因此柱前反应器 多采用简单的被动混合原理。“T”和“Y”型两种混 合管道结构简单、制作难度小 ,是目前微流控分析芯 片上应用最为广泛的反应管道构型[54 ] 。两液流完 全依靠分子扩散来实现混合 ,混合速度取决于混合 管道的宽度和分子的扩散系数。混合器所能达到的 混合效率取决于微管道的长度 , 但大多设计没有进 行优化 ,其混合效率也就难以保证。Wang 等 [52 ] 对 柱前“T”型酶反应管道(图 521) 尺寸进行了优化 ,反 应池宽度(200μm) 为进样管道宽度的 4 倍 ,这样可以 减小反应液流的电渗流 ,使反应更充分。使用这种 反应管道进行了葡萄糖、V 型神经递质[55 ] 及氨基酸 的柱前反应及分离检测[56 ] 。有限长度的直混合管 道的混合能力毕竟是有限的 ,而折叠弯管既可以延 长混合管道长度 ,又能在弯管处形成二次流扰动混 合液流[57 ] ,增强混合。Cheng 等 [58 ] 的柱前免疫反应 器(图 522) 和 Cohen 等 [54 ]的柱前酶反应器(图 523) 利 用了这一原理 ,在“Y”型混合管道中增加了“U”型折 叠弯管来增强反应液流的传质能力。De Boer 等 [59 ]利用同样的原理设计了集成有反相色谱分离的组织 蛋白酶 B 的微流控酶反应器 ,用于生物活性物质的 筛选。Belder 等 [60 ]设计的柱前酶催化反应管道引入 了多个方型弯管来增强混合。

图 5 集成有 T型和 Y型柱前反应器的电泳芯片[52 ,54 ,58 ]

Fig. 5 CE2microchips with T or Y pre2column reactors[52 ,54 ,58 ]

我们通过计算机模拟计算发现 ,引入 3 个“U” 型折叠弯管的混合管道的混合效率比等长的“Y”型 直混合管道高 20 %。十字型混合管道可以同时注 入 3 种反应物液流形成夹流混合 ,进行反应 ,适合于 酶的抑制分析和竞争免疫分析。Roper 等 [5 ] 采用十 字型柱前反应管道(图 621) 将胰岛素和 FITC 标记的 胰岛素与抗胰岛素抗体同时引入反应管道进行竞争 免疫反应分析。Hadd 等 [61 ] 用 T 型混合器作为酶底 物的稀释管道 ,在稀释管道下游设计了十字型管道 用于酶、底物和酶抑制剂的混合反应(图 622) 。

图 6 集成有十字型柱前反应器的电泳芯片[5 ,61 ]

Fig. 6 CE2microchip with cross shaped pre2column reactor[5 ,61 ]

多级层流混合器有着很高的混合能力 ,虽然目 前还没有将其用作酶或免疫反应器的报道 ,但已被 用作生物胺的芯片电泳柱前荧光标记反应管道[7 ] (图 7) 。我们研究组通过计算机模拟发现 ,对混合 液流进行 4 次拆分的多级层流混合器 ,罗丹名 6G在 6mm 的混合距离内可以达到 99 %的混合效率 ,远远 高于其它构型的被动混合器。

图 7 集成有多级层流柱前反应器的电泳芯片[7 ]

Fig. 7 CE2microchip with multi2channel pre2column reactor[7 ]

柱前均相反应需要灵活精确的液流控制来保证 反应和分离检测的同时进行以及准确的进样。在压 力驱动的芯片装置上 , Kerby 等 [62 ] 根据流体力学计 算设计网络管道 ,利用管道宽度的不同(10 —100μm) 来控制流体阻力 ,进行反应液流控制。在电驱动微 流控芯片装置上 ,根据电流和试剂流量的定量关系 , 通过调节电流的大小和方向来控制反应试剂的稀释 浓度以及液流的流向是较为常用的方法[54 ,61 ,63 ] ,也 是比较容易实现的。为了使柱前反应和分离检测同 时进行 ,反应管道和分离管道需要设计成独立的流 路 [54 ] 。Roper 等 [5 ]设计了单个电源控制的免疫电泳 芯片 ,用来检测由胰岛分泌的胰岛素。反应管道和 · 428 · 化 　学 　进 　展 第 19 卷 分离管道采用并联式设计 ,使用同一个废液池(图 62 1) ,反应和分离过程同时进行 ,15s 内可完成整个分 析过程。对于有些较慢且需要加热的酶反应 ,要使 反应充分进行 ,可以采用溶液停留技术使反应物在 加热区域滞留 ,控制反应时间使之反应完全[64 ,65 ] 。 门式进样是集成有柱前反应器电泳芯片系统最理想 的进样方法 ,这种进样技术可以满足反应和进样的 快速切换。

微流控分析芯片多次操作重复性较差一直困扰 着众多研究者 ,尤其是集成了柱前反应之后 ,复杂的 流体操作更难以保证分析结果的重现性 ,这对于需 要多次平行测定的酶反应动力学滴定分析及竞争免 疫分析是极为不利的。集成多通道的微流控分析芯 片单次操作就可以完成一系列的滴定操作 ,弥补了 这一缺陷。Cheng 等 [58 ]设计了六通道的集成免疫反 应电泳芯片(图 522) ,用来进行卵清蛋白(ovalbumin) 和抗卵清蛋白的免疫反应和荧光扫描检测。Kang 等 [51 ]将高通量的微流控混合反应器与孔板中荧光 显影检测相结合 ,利用压力驱动的浓度梯度混合器 使酶底物形成一系列浓度 ,同时平行注入下游孔板 中 ,与从相反方向注入的碱性磷酸酶在孔板中反应 , 然后通过孔板荧光显影进行检测 ,一次操作就可以 完成酶的滴定(图 8) 。这种方法巧妙地结合了微流 图 8 酶活性滴定分析微流控芯片[51 ] Fig. 8 Microchip used for enzyme activity titration[51 ] 控芯片灵活的流体处理能力和生物芯片的高通量平 行检测的优点。Duffy 等 [66 ]设计了 48 通道的圆盘式 芯片系统 ,在离心力驱动下进行茶碱的酶抑制动力 学研究 ,一次操作就可以完成 3 次平行滴定 (15 个系列浓度) ,总的分析时间为 3min。多通道集成的 酶抑制分析和竞争免疫分析微流控芯片装置 ,很大 程度上降低了常规实验室操作以及单通道微流控操 作多次测量引入的偏差 ,大大缩短了分析时间。但 是也必须看到 ,有限面积的芯片上集成了大量的样 品池 ,手工加样操作较烦琐 ,而且很容易造成试剂污 染 ,这也是集成芯片系统需要解决的问题之一。

图 8 酶活性滴定分析微流控芯片[51 ]

Fig. 8 Microchip used for enzyme activity titration[51 ]

（2）微管道柱后反应

柱后反应会直接导致样品分离谱带的展宽 ,影 响电泳分离的柱效。但是有些反应 ,如蛋白质的荧 光标记[65 ] 、化学发光衍生反应[67 —69 ] ,有时不得不采 用柱后衍生。Liu 等 [70 ]在电泳芯片上设计了柱后化 学发光衍生管道 ,采用萤火虫荧光素Π荧光素酶生物 发光体系 ,对大肠杆菌细胞萃取液进行了 ATP 及 ATP 代谢物的检测(图 9) 。蛋白质的荧光标记反应 一般发生在氨基或其它活性基团上 ,蛋白质分子中 多个反应点的存在 ,可衍生出多种电泳淌度不同的 物质 ,而且荧光染料与氨基的吸附使得蛋白质分子 淌度差减小 ,更难以进行电泳分离 ,因此蛋白标记多 采用柱后衍生[71 ] 。

图 9 集成有柱后反应器的电泳芯片[70 ]

Fig. 9 CE2microchip with post2column reactor[70 ]

同时集成有柱前和柱后反应器的电泳芯片 (图 1021) [64 ] ,对管道设计和电压的施加方式都有很高的 要求。首先流路的设计必须保证反应和分离过程不 相互冲突 ,各种试剂不交叉污染 ,缓冲液的 pH 值不 影响酶或抗体的活性以及能够通过控制电压来控制 各种试剂的流量。最重要的问题是如何通过优化管 道的设计 ,使柱前和柱后反应不至引入太大的柱效 损失。

Wang 等 [3 ]在电泳芯片上集成柱前反应器进行 酶标记抗体(抗人胰岛素) 和抗原(胰岛素) 的免疫反 应及葡萄糖脱氢酶 ( GDH) 和葡萄糖在辅酶 (NAD+ ) 存在下的酶反应 ,电泳分离后在柱后反应管道中进 行碱性磷酸酶和其底物 ( p2nitrophenyl phosphate ( p2 NPP) ) 的衍生反应 ,安培检测 NADH 和 p2NP 产物 (图 1022) 。用同样的装置 ,在柱前反应器进行磷酸 酯酶标记抗体(anti2mouse IgG) 和抗原 (mouse IgG) 的 免疫反应 ,然后电泳分离免疫复合物和未反应的抗 第 5 期 徐 　溢等 　微流控分析芯片上生化反应技术研究进展 · 528 · 体 ,在柱后进行酶示踪物质与 42aminophenyl (PAPP) 磷酸底物衍生化反应 ,生成电化学活性的 42氨基酚 (PAP) 进行安培检测。分析表明抗体和抗原的电迁 移率相差较大 , 柱前柱后反应导致明显的谱带 展宽[72 ] 。

图 10 同时集成柱前和柱后反应管道的电泳芯片[3 ,64 ]

Fig. 10 Electrophoresis microchips integrated both pre2and post2column reaction channels[3 ,64 ]

目前关于混合管道的研究已经相当深入 ,人们 提出了各种用来提高混合器混合效率的方法[73 —75 ] 。但是可以看出 ,真正用于微流控分析芯片上混合反 应的设计只有被动混合器 ,而且也只是最简单的T型或Y型管道结构。这种结构的混合反应管道 ,其 混合效率实际上是有限的。微流控分析芯片最终的 目的是分析 ,复杂的反应处理会影响测定的重复性 , 降低分离柱效。如何权衡这两者的关系将是微流控 芯片研究者需要解决的问题。

微流控芯片上酶联免疫反应

酶联免疫分析(ELISA) 最常见的是在 96 孔板上 进行。常规的 ELISA 由于其单调费时的处理过程 , 经常导致错误的结果。分析过程中需要一系列的混 合和清洗过程 ,由于每一步都要较长的温育时间 ,一 次分析经常需要两天的时间 ,这个时间是由于抗体Π 抗原较低的传质效率造成的 ,而免疫反应本是快反 应。微流控芯片高通量和流体驱动方便的特点已使 越来越多的研究者尝试着将 ELISA 转移到微流控芯 片上来进行[76 —78 ] 。Lai 等 [79 ] 设计了圆盘形离心力驱 动的 96 通道 ELISA 分析微流控装置(图 1121) ,用来 进行鼠杂种瘤培养细胞中鼠 IgG抗体分析。每个通 道上有 11 个贮液池用来引入反应物和洗脱液 ,在每 个贮液池下方设计毛细管阀进行液流控制 ,精确的 管道几何设计使单个储液池中的溶液充满检测池而 不泄露到其它液池。通过调节转速 ,离心力和毛细作用力相互竞争分别完成每一步反应和相应的清洗 过程[79 ] 。每步反应试剂消耗为 1μl ,整个分析时间 降到了 30min。

图 11 酶联免疫(ELISA) 衍生反应微流控装置[79 ,80 ]

Fig. 11 Microfluidic devices of ELISA derivatization[79 ,80 ]

肉毒菌神经毒素是毒性最大的底物 ,人的致死 量为 1ngΠkg。使用常规治疗方法需要 4 天的时间 , 而目前肉毒菌中毒最有效的治疗方法就是中毒后尽 快处理毒素 ,但必须在毒素和神经结合之前(24h) 进 行。芯片上的检测可大大缩短检测时间。Moorthy 等 [80 ]用他们设计的 ELISA 微流控装置 (图 1122) 直 接检测全血样品中的肉毒菌神经毒素。该装置集成 了混合器、水凝胶滤膜以及阀门 ,实现了过滤、混合、 温育和样品预处理过程。为了检测类毒素 ,在链锁 球菌处理的琼脂糖胶微珠上固定维生素 H 抗体 ,第 二抗体上的磷酸酯酶与酶底物反应生成不溶的有色 · 828 · 化 　学 　进 　展 第 19 卷 沉淀包覆在微珠上 ,使裸露的染料便于检测。使用 这个装置可以检测到全血中临床相关量的毒素。

微流控芯片上含氮氧化物检测的反应

含氮氧化物在生理学上是很重要的信号化合 物 ,包括神经传递、血管舒张和发炎等症状。含氮氧 化物可转化成硝酸盐和亚硝酸盐混合物 ,最常用的 检测方法是 Griess 反应。Hanajiri 等 [81 ] 在电泳芯片 样品池中放置铜包覆的镉颗粒将样品中的硝酸盐转 化成亚硝酸盐 ,用间接安培检测法检测含氮氧化物 释放剂 (32morpholinosydnonimine) 释放出的硝酸盐和 亚硝酸盐。Goto 等 [82 ] 使用鼠腹膜巨噬细胞为模型 , 在玻璃芯片上集成了细胞培养、Griess 反应、酶反 应、温度控制以及热透镜检测 ,实现了脂多糖刺激细 胞释放氮氧化物的检测。与常规的检测方法相比 , 其总的分析时间由 24h 减少到 4h ,检测限由 10 - 6 molΠL 降到 7 ×10 - 8 molΠL。

微流控芯片上的 PCR反应

聚合酶链反应已成为核酸分析的主要方法 ,被 广泛用于 DNA 序列扩增反应、临床诊断和人类基因 测序等。目前 PCR 微流控芯片主要集中于反应功 能芯片的研究。PCR 装置不但要求巧妙的流路设 计 ,还需要集成加热器和温度传感装置[83 ] ,因此 PCR 芯片只用作反应功能芯片[84 —86 ] 。Ivonne 等 [8 ] 对 PCR 反应功能芯片做了详细的综述。扩增产物最终 要进行分析检测 ,产物与电泳分离检测以及其它检 测方式接口的研究是非常重要的。本文只讨论与芯 片电泳联用的集成 PCR 反应器。

集成在电泳芯片上的 PCR 反应器与 PCR 反应 功能芯片不同 ,因为它必须兼顾电泳分离过程 ,而电 泳分离过程在温度要求上刚好与需要循环加热的 PCR 反应相反 ,要达到较高的分离柱效 ,分离管道系 统的温度应尽可能低。这就要求 PCR 反应器仅在 反应区域局部加热 ,而且要有良好的散热功能。最 简单的设计是直接在样品池中进行 PCR 反应 ,将整 个芯片放在常规循环加热器上进行加热和控 温 [87 ,88 ] 。利用这种加热方法 Dunn 等设计了用来测 定老鼠基因多态现象的 PCR 电泳芯片 (图 1222) 。 这种设计实际上并没有将 PCR 反应集成到电泳芯 片上 ,从反应到分离过程的操作也是不连续的。 Hataoka 等 [89 ]使用标准 DNA 芯片 ,在片上加工了铝 片加热器 ,进行前列腺特征抗体碎片的扩增及电泳 分析。珀耳帖(Peltier) 是很成熟的一种微电子元件 ,可直接贴在 PCR 反应管道上很方便地实现局部温 度控制。Wook 等 [90 ]制作的 T 型 PCR 柱前反应器使 用了这种加热元件 ,热电偶帖在片上用作温度传感 , 进行 λDNA 扩增及产物的凝胶电泳分离检测。 Lagally 等 [91 ]在 PCR 电泳芯片上通过电沉积加工金 加热器和 Pt 温度传感器 ,进行病原体和大肠杆菌的 基因扩增和电泳分离检测(图 1221) 。这种制作方法 才是真正意义上的 PCR 电泳芯片 ,因为它完全从电 泳芯片的整体结构出发 ,设计并制作 PCR 柱前反应 器 [92 ] 。

图 12 PCR 产物检测电泳芯片[88 ,91 ]

Fig. 12 Electrophoresis microchip for PCR products detection[88 ,91 ]

PCR 反应需要较长时间 ,反应过程中必须保证 反应物保持在反应室而不流到其它管道 ,而且扩增 产物一般需要进行凝胶电泳分离 ,在分离管道充入 凝胶的过程中还必须保证其不进入 PCR 反应室。 这就要求在反应室和分离管道之间设计阀门。紧缩 管道是较为常用的停止阀[87 ,90 ] ,即在反应管道过渡 到分离管道的区域设计一段宽度很小的过渡管道 , 窄管道的流体阻力可起到阀的作用。Lagally 等 [91 ] 制作了 PDMS 膜阀来控制样品的位置 ,对进样管道 和 PCR 反应池的几何构型进行了优化 ,准确控制筛 分介质进入分离管道。

结论与展望

综上所述 ,越来越多的生物化学反应被集成到 微流控芯片上。酶和免疫反应的高特异性、PCR 反 应的信号增强 ,以及其它反应的灵活性与微流控装 置的高通量、低试剂消耗、灵活的流路设计和高集成 能力相结合 ,一改传统实验室生化分析和临床诊断 第 5 期 徐 　溢等 　微流控分析芯片上生化反应技术研究进展 · 928 · 所存在的操作过程不连续、废时和成本高等缺点。 但也必须看到 ,生化反应在微流控分析芯片上的集 成还处在快速发展阶段 ,尚不成熟。芯片操作的重 复性较差 ,芯片上生化反应的可控性不强 ,集成能力 还不够高是微流控芯片发展亟待解决的问题。可以 肯定的是 ,集成有生化反应的微流控分析芯片正在 朝着临床诊断、药物筛选、核酸分析和环境监测等领 域快速发展 ,并显示出强大的应用潜力。

文献来源：中图分类号 : O652 ; R39211 ; Q55 文献标识码 : A 文章编号 : 10052281X(2007) 0520820212 作者：徐溢，吕君江，范伟，温志渝

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