微流控“迷你大脑”：跟上芯片上大脑技术的步伐

由于人口老龄化，阿尔茨海默病(AD)或帕金森病等神经退行性疾病的数量也在扩大。根据世界卫生组织的数据，世界上有近10亿人患有神经疾病，包括癫痫、阿尔茨海默病、脑血管意外、神经感染等….

在第三个千年之初，由于长期老龄化，神经发育障碍日益严重，有必要对大脑有更深入的了解。

Rita Levi-Montalcini，1986年诺贝尔医学奖

我们越来越需要一种体外模型来评估治疗药物对大脑的神经毒性，并通过分析脑区的功能和相互作用来研究神经疾病。事实上，小鼠或大鼠大脑的活体模型已经得到了广泛的应用，但都是有限的。马歇尔和罗威尔观察到，动物试验方法不足以正确预测药物疗效并挑选出替代方法的优点。此外，神经元的可塑性是大脑复杂性的主要原因之一，用现有的传统体外模型很难再现。帕米斯和艾尔声称微生理系统提供了对大脑生理和功能的三维(3D)模拟的可能性。一种高效的脑芯片可以通过对大脑的一小部分进行建模，如Griep和al在2013年所做的那样，帮助发展对中枢神经系统的全球理解。Dauth等人对不同大脑区域之间的相互作用进行了建模。

与大脑微流控芯片概念相关的挑战

重现大脑的复杂性
由于神经元的可塑性和细胞间的相互作用，对人脑的复杂性进行建模是一个巨大的挑战。不同类型的细胞在大脑中相互作用：神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞注意到Pamies等人。他们观察到，星形胶质细胞和神经元需要以3D方式相互作用，以适当地改善突触连接，并涉及更好的细胞成熟。2D共培养进行了测试，提供了比正常培养神经元更好的结果，但没有给予足够的自由来构建有趣的神经元网络，一个星形胶质细胞与几个神经元结合。结合不同类型的细胞是一部分，但Dauth等人还要注意多区域体外模型的缺乏。他们提出了一种基于大脑主要通过不同区域之间的通信来活动的观察结果的多区域脑芯片。事实上，大脑区域表达的神经元具有不同的电化学性质，即不同的动作电位阈值，不同的蛋白质水平等…

图1：突触示意图，显示神经元和有髓轴突的内部

脑血管界面的建模

脑模型的另一个关键点是血脑屏障(BBB)，它对于评估脑毒性是极其重要的。这种生化膜结构是大脑特有的。它由内皮细胞组成，紧密连接，将血液和中枢神经系统的细胞外液分开。帕米斯和艾尔准确地说，神经元离毛细血管的距离大多在8-20μm以内。水、O2、CO2、荷尔蒙等小分子可以被动地进入大脑，葡萄糖或氨基酸等其他基本分子可以通过主动运输通过屏障。
根据研究人员的说法，大脑的血液流动对大脑的发育和功能起着作用。血脑屏障的故障可以部分导致神经退行性疾病。内皮屏障的半通透性是维持脑内平衡所必需的，不允许神经毒性分子进入，然而，许多治疗药物也被阻止。一个可靠的血液和脑间质液界面模型似乎有助于研究这些神经疾病，评估药物的交叉和效果。体外模型对于低成本的大规模研究很有兴趣，但很少是动态的。格里普和艾尔。展示了基于人体细胞的血脑屏障3D-微流体模型通过添加剪应力来包括血流运动的可能性。这种BBB芯片只持续七天，但显示出开发神经疾病模型的潜力。
Park和al在微流控脑芯片上模拟了大脑环境，并模拟了间质流体流动。他们使用他们的微芯片来模拟阿尔茨海默病(AD)中由淀粉样β蛋白引起的神经退化。为了更好地了解片上脑技术及其潜在的应用，将对该模型进行更详细的描述。

基于芯片器官技术的阿尔茨海默病模型的技术特征

本节和下一节将介绍最近开发的用于阿尔茨海默氏症研究的大脑芯片，由Park.J.和al共同开发。其目的是开发一种更接近于体内观察到的大脑环境的设备，具有相应的3D细胞结构。因此，他们将他们的芯片建立在三维神经球体上，正如在大脑间质空间中观察到的那样，这些球体受到持续流动的液体的影响。为了形成大小均匀的均匀神经球体，他们使用了带有凹面微孔的芯片。在Park等人开发的渗透微泵系统的帮助下，介质的连续流动被提供。该芯片采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作而成，由顶部腔体和底部50个圆柱孔组成。这些神经元是从大鼠胚胎大脑皮层分离的原代皮质神经元。在建立了一个模拟正常大脑的微流控芯片后，Park等人说将调整他们的大脑芯片来模拟AD的大脑。

图2：大脑芯片设备的原理图。该装置连接到提供间隙流动的渗透微泵。该芯片是基于3D神经球体的。淀粉样蛋白-β被添加到阿尔茨海默病模型中。

淀粉样蛋白-β是一种多肽，被发现与阿尔茨海默病有关，是患者大脑中淀粉样斑块中的主要成分。为了正确研究阿尔茨海默病，他们分成了四组，在不同的培养条件下：第一组对应于对照组，神经球体没有流动，第二组对应于相同的条件，但添加了淀粉样蛋白β，最后第三组和第四组分别是有流动的神经球体培养，没有和添加淀粉样蛋白β。根据所在组的不同，细胞在“正常”神经基础培养液(Gibco)中培养10天或7天，然后在含有淀粉样蛋白-β的培养液中培养3天。

图3：模拟正常大脑的微流控芯片(A)和模拟阿尔茨海默病大脑的微流控芯片(B)的示意图。(A)在正常条件下，在氧气和营养条件下培养神经球体10天。(B)在阿尔茨海默病的情况下，细胞在氧气和营养物质的作用下只培养7天，然后在含有淀粉样蛋白-β的培养液中培养3天。

微流控大脑芯片取得的成果

血流对神经球的影响
为了确定持续向细胞添加营养物质、细胞因子和氧气的不同后果，他们比较了静态组和非静态组。第一个明显的区别是全球规模。第0天，两组神经球体平均大小相同。10天后，他们做了同样的测量，发现连续流动培养的神经球体增加(有一个模式：细胞朝着出口变小)，而其他细胞保持不变。两组之间的第二个差异似乎是由间质流动直接导致的，即芯片上形成网络的模式。事实上，神经球体中神经突起的伸展程度更大，这直接意味着神经网络的形成更强健。突触蛋白IIa的免疫染色证实了这一点，突触蛋白属于突触蛋白家族，参与突触神经递质的释放。在动态模型中，这种突触标记的强度要高得多，这意味着持续的流动也促进了突触的形成。事实上，使用另外两个标记：B-III微管蛋白作为神经元标记和Nestin作为神经干细胞标记，表明在持续的血流下，神经前体细胞向神经元的分化被促进。Parks和al注意到，间质流动是将营养物质、细胞因子和氧气输送到细胞中，从而参与突触网络形成所必需的。

图4：神经网络在静态组和动态组中的形成。(a和c)神经网络形成的扫描电子显微镜图像，神经突起用白色表示。(b和d)神经网络形成的光学图像，神经突起用白色表示。(e和f)通过测量每个微孔切片中神经突起的平均数量和神经球体的平均大小来分析神经网络的形成。

淀粉样蛋白-B的作用
在一半的培养物中加入淀粉样蛋白B，使他们能够研究这些蛋白质如何影响神经球体。他们使用硫黄素S对神经球进行染色，并研究淀粉样蛋白B的存在和分布。首先，他们观察到，在动态血流模型中，神经球体中残留的淀粉样蛋白B的数量更多。在对死亡细胞进行量化后，正如预期的那样，他们显示，含有淀粉样蛋白B的培养物活细胞较少，这与这种蛋白的神经毒性和凋亡作用相对应。他们报告说，突触素、微管蛋白和巢蛋白水平较低，这也与神经网络的破坏有关。

所描述的阿尔茨海默病模型的结论

通过对Parks&al的不同培养案例的比较，一些有用的信息出来了。首先，3D细胞架构在大脑微环境的再现方面提供了良好的结果。增加间质液体流动的结果有助于这种芯片上脑作为药物筛选和细胞毒性测试工具的潜力，因为它有助于实现更强大的神经元形成，加速神经前体细胞向成熟神经元的分化。这可能是由于营养物质和富含氧气的新鲜介质的持续供应，以及代谢废物的流动所致。
关于淀粉样蛋白-B测试，不同的观察结果使Park和al.。以确定该蛋白的神经毒性和凋亡作用，从而进一步诱导突触功能障碍。由于这种蛋白质被认为是导致阿尔茨海默氏症的原因，淀粉样蛋白B对3D微培养的影响为建立快速、低成本的神经退化模型打开了可能性。在静态条件下，Park和al观察到淀粉样蛋白-B的作用更显著，与流动条件下的扩散相比，一致的是仅通过简单的扩散进入神经球体。然而，你会认为在间质血流的情况下淀粉样蛋白B会被移除。这并不是处于兴趣使然的研究，因为在没有新鲜介质供应的情况下，淀粉样蛋白B的供应是持续的。

更多有关于大脑芯片的应用场景

在器官芯片技术中，再循环是一个常见的问题，特别是当几个器官组合在一起创建一个多器官芯片时，也能被称为芯片上的人类模型。对于毒性测试和药理学研究来说，这一点很重要，但在允许相互作用的同时混合不同的细胞培养物，是非常具有挑战性的。事实上，正如Rogal等人注意到的那样，毒性不足以仅限于一个器官，它主要通过多个器官途径发挥作用。。对于大脑与其他器官相关的3D培养，BBB前面所描述的才是重点。然而，如果将BBB-on-Chip模型应用于人类神经细胞，则会更好。IPSCs细胞具有产生人类神经元的惊人潜力，但正如Dauth和al所解释的那样。还不能区分特定的大脑区域。这些神经元属性(细胞组成、蛋白质表达、新陈代谢等)跨大脑区域的差异需要在下一版本的设备中进行研究。