可通过快速筛选允许细胞来分离病毒的微流控细胞芯片

摘要

病毒鉴定不仅是病毒性传染病早期诊断的前提，也是有效预防流行病的前提。根据科赫假设，成功培养是识别病毒的黄金标准。然而，这需要筛选一种宽松的细胞系，这在传统上是时间、试剂和劳动密集型的。本文报道了一种简单易操作的微流控芯片，该芯片通过接种多种细胞系并平行培养而形成，可用于病毒培养和病毒允许的宿主细胞筛选。该芯片通过感染两种已知病毒进行测试，即肠道病毒 71 （EV71） 和流感病毒 H1N1。EV71 和 H1N1 感染分别在 RD 和 MDCK 细胞中引起显著的细胞病变效应 （CPE），表明基于这种微流控细胞芯片的病毒培养可以替代传统的基于平板的培养方法，并重现病毒感染引起的典型 CPE。使用这种微流控细胞芯片方法进行病毒培养，可以以高通量、自动和前所未有的快速方式识别新出现的病毒。

1. 引言

新发和再发传染病，如严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（SARS-CoV）-2 和 SARS-CoV对人类构成致命威胁。此外，2013-2016 年西非埃博拉病毒疫情导致 28,000 多例病例，占相关死亡人数的一半以上。在感染病毒性疾病的早期阶段，避免患者恶化和预防其他致命并发症的先决条件是确认病毒类型或亚型。只有在确定病毒种类后，我们才能利用现有知识采取措施。因此，病毒的快速识别对于早期诊断和疫情防控至关重要。各种方法，包括血凝抑制和中和试验，核酸扩增，免疫荧光测定，酶联免疫吸附测定和下一代测序，通常应用于病毒的早期诊断。目前，定量逆转录-PCR是病毒早期诊断的首选方法，因为它具有高特异性和高灵敏度的优点。然而，根据Koch假设，基于活病毒细胞培养的噬菌斑测定是病毒鉴定和诊断的金标准。对于新出现的病毒，应用斑块检测的主要问题是需要筛选病毒允许的细胞系。使用平板或培养皿进行细胞和病毒培养的传统方法耗时且耗费试剂，劳动密集型且灵敏度低。

基于微机电系统（MEMS）的微流控芯片可以处理微/纳升尺度的流体，因此需要的试剂和临床样本量要少得多。更重要的是，通过使用微流控细胞芯片，可以实现具有不同细胞系和培养条件的高通量并行测试。特别是当微流控细胞芯片与处理和控制设备集成时，创建自动高通量培养和筛选系统将成为可能。

本文设计了由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）上下盖板、聚乳酸（PLA）框架、聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片和底部金属框架组装而成的微流控芯片，用于培养不同的细胞系，以筛选病毒允许的细胞。在PDMS芯片上同时培养用于病毒培养的5种常见宿主细胞系A549、BHK21、Vero、RD和MDCK。通过逐渐改变培养基含量，使不同的细胞系适应相同的培养基。然后，以肠道病毒71型（EV71）和流感病毒H1N1为模型病毒，在微流控培养系统中测试细胞芯片，以筛选病毒允许的细胞。与传统的实验室培养方法相比，该细胞芯片可以重现被测病毒的典型细胞病变效应（CPE），并具有允许筛选多种潜在宿主细胞系以获得最佳病毒允许细胞系的额外优势。这项研究为开发高通量细胞培养芯片铺平了道路，这些芯片将有助于有效的病毒分离和抗病毒药物筛选。

2.材料与方法

2.1. 设备设计与生成

微流控芯片由上下芯片盖、芯片框架和PDMS培养芯片组成。上下芯片盖板通过激光切割由PMMA板预制而成，金属框架由铝板通过计算机数控（CNC）加工直接制造而成。使用桌面 delta RepRap 3D 打印机 3D 打印尺寸与 PDMS 培养芯片尺寸相对应的 PLA 框架。器件设计和组装的详细原理图如图1所示。

图 1.微流控芯片设计与制造示意图.用于制造微流控芯片的定制模具技术的工艺。

首先，通过SolidWorks设计PDMS细胞培养芯片模具，并将设计文件转换为STL文件，由3D打印机识别。其次，PDMS芯片模具通过DLP或SLA3D打印机在不到一个小时的时间内实现，所得打印模具经过物理或化学抛光，产生光滑的槽面。第三，将脱气的PDMS预混料（Sylgard 184）倒入模具中，将模具置于70°C的烘箱中1 h，使液体PDMS固化。然后缓慢而小心地将固化的PDMS芯片从芯片模具中剥离。组装微流控芯片后的最后一步，是用螺丝密封芯片并安装入口/出口连接器。

2.2. 研究中使用的细胞系和病毒株

本研究中使用的所有细胞系均购自美国组织型培养保藏中心（ATCC，美国）。使用以下五种哺乳动物细胞系进行研究：人腺癌肺泡基底上皮细胞（A549，CCL-185），非洲绿猴肾细胞（Vero，CCL-81），Madin-Darby犬肾上皮细胞（MDCK，CCL-34），人横纹肌肉瘤细胞（RD，CCL-136）和仓鼠肾成纤维细胞（BHK-21，CCL-10）。为了维持，BHK-21、MDCK和RD细胞在补充有10%胎牛血清（FBS，10099-141C，Gibco）和100单位/ mL青霉素 - 链霉素的最小必需培养基（MEM，41500，Gibco，Thornton，Australia）中培养，在37°C的5%CO 2气氛中;在相同条件下将 A549 和 Vero 细胞维持在 DMEM 中。对于感染，EV71 使用含有 1% FBS 的 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM，12800，Gibco），将含有 2% 牛血清白蛋白（BSA，H1130，Solarbio，北京，中国）和 2 μg/mL TPCK-胰蛋白酶（9002-07-7，Macklin，上海，中国）的 DMEM 用于甲型流感病毒。在与微流控芯片平行的 96 孔板的实验中，使用与芯片相同的介质。

人EV71（中国疫苗株，GenBank编号。HQ328793，武汉病毒研究所微生物和病毒培养物收集中心）和甲型流感病毒[A/Puerto Rico/8/1934（H1N1），武汉病毒研究所微生物和病毒培养物收集中心]分别在RD细胞和MDCK细胞中传代了四个周期。所有感染实验均在BSL-2实验室进行。

2.3. 病毒滴度计算

在 96 孔板中接种 1 × 104 个细胞/孔的 RD 或 MDCK 细胞。将病毒的连续 10 倍稀释液加入孔中。将细胞和稀释的病毒一起孵育48小时后，在倒置显微镜的明场设置下检查CPE，并按照Behrens-Reed-Muench方法计算病毒50%组织培养感染剂量（TCID50）。将所得病毒滴度为7 × 108 TCID50/mL（EV71，补充表S1）和1.6 × 108 TCID50/mL（甲型流感病毒，补充表S2），在-80°C下储存直至进一步使用。在感染实验中，感染的多重性（MOI）计算为病毒滴度PFU，其由TCID50（Bryan，1957）转换而来，使用公式为：MOI = PFU /（接种细胞数）。

2.4. 芯片上细胞系培养

PDMS培养室涂有0.1mg / mL聚-l-赖氨酸（BS197，Biosharp，合肥，中国），灭菌，然后在4°C下储存过夜。用磷酸盐缓冲盐水冲洗后，将芯片风干。将 A549、Vero、RD、BHK-21 或 MDCK 细胞以 1 × 104/孔的密度接种到芯片室中，与其他芯片组分组装在一起进行连续静态培养。芯片上的培养基是含有 1% FBS 的 DMEM，每 12 小时以 2 mL/h 的流速灌注 0.5 小时，直至培养过程结束。在接种后6小时和12小时，使用配备数码相机的倒置显微镜（IX73，Olympus，Tokyo，Japan）对细胞进行成像。

2.5. 96孔板中的病毒感染

96 孔板中的细胞在指定的 MOI 处被 EV71（A549、Vero 和 RD 细胞）或流感病毒 H1N1（A549、Vero 和 MDCK 细胞）感染。在感染后指定的时间点，使用配备数码相机的倒置显微镜（IX73，奥林巴斯）对细胞进行成像。

2.6. 芯片上的病毒感染

在感染前12小时将细胞接种在芯片的培养室中。然后，将包含加载单元的PDMS芯片小心地嵌入PLA框架中，其余的芯片组件按顺序组装。A549、Vero 和 RD 细胞在指定的 MOI 处感染 EV71。A549、Vero 和 MDCK 细胞在指定的 MOI 处感染流感病毒 H1N1。在感染后指定的时间点，使用配备数码相机的倒置显微镜（IX73，奥林巴斯）对细胞进行成像。芯片上细胞排列（对应含病毒样本的流向）为EV71感染的A549-Vero-RD、A549-RD-Vero或RD-A549-Vero，H1N1感染的A549-Vero-MDCK、A549-MDCK-Vero或MDCK-A549-Vero。每次感染试验重复三次。

为了定量流感病毒H1N1 RNA，将A549、Vero和MDCK细胞接种在96孔板或如上所述的芯片上，然后在指定的MOI下感染流感病毒H1N1。同样，样本是在感染后指定的时间点冷冻后收获的。采用甲型流感病毒核酸检测试剂盒（DAJY-001-24T，中山大学大安基因有限公司，中国广州）和一步法实时荧光PCR检测病毒复制水平。样品制备和反应系统按照制造商的说明进行。在Bio-Rad CFX Connect RT-qPCR仪器（CFX96）上处理样品，并使用CFX Manager（3.1版）进行数据分析。

3. 结果

3.1. 微流控芯片的设计与组装

从上到下，由PMMA（作为上盖）、PLA（作为框架）、PDMS（作为培养芯片）和PMMA（作为下盖）在金属框架内组装出微流控芯片器件。PDMS芯片的尺寸为70 mm×28 mm×3.3 mm，内置培养室直径为6 mm，高度为2 mm。最初安装芯片时，以 2 mL/h 的速率将培养基注入细胞室。为了通过提供足够的营养和氧气来支持细胞的生长，每 12 小时以 2 mL/h 的速度注入培养基 30 分钟（图 2）。每个细胞培养室的体积为56.52μL。每个芯片有 10 个腔室，单个芯片的总腔室体积为 565.2 μL。连接腔室和外部管路的微流体通道内的总体积为 314 μL。因此，腔室、通道和管道体积的总和为 879.2 μL，小于 1000 μL。因此，使用2 mL/h的流速30分钟，进样1000 μL新鲜培养基，足以替换整个芯片的培养基。

图 2.微流控芯片的原理。PMMA，聚甲基丙烯酸甲酯;PDMS，聚二甲基硅氧烷。

这种设计的优点在于，通过使用三维（3D）打印，可以在短时间内实现定制的芯片通道结构（图1）。与传统的微流控细胞接种相比，细胞培养室的表面易于预处理，在单个芯片中也很容易实现不同细胞系的接种。此外，PDMS芯片可以在细胞接种完成后组装成微流控器件，从而通过将各种PDMS芯片与不同的细胞集成来重建微流控芯片。

3.2. 在微流控芯片上培养不同细胞系

A549，Vero，RD，MDCK和BHK-21细胞系，它们对不同的病毒（包括肠道病毒，单纯病毒，水疱病毒，埃博拉样病毒和黄病毒）敏感（Phanthanawiboon等人，2014;Alonso 和 Compans，1981 年;Puhl 等人，2021 年;Shen 等人，2019 年;Xiao 等人，2020 年;Lee 和 Fuller，1993 年;Drews 等人，2019 年），被选为构建芯片时测试的潜在病毒允许细胞。然而，这些细胞需要不同的培养条件。BHK-21、MDCK 和 RD 细胞需要 MEM，而 A549 和 Vero 细胞需要 DMEM。为了在相同条件下在芯片上培养这些不同的细胞系，通过使细胞逐渐适应来建立含有 1% FBS 的 DMEM。结果，所有五种细胞系在接种后都能粘附在芯片的底物上，并显示出正常的形态和活力（图 3 和图 4）。

图 3.在 96 孔板中比较在 MEM 与 DMEM 中培养的五种细胞系的细胞形态和活力，均含有 1% FBS。

图 4.在芯片上培养多种不同的细胞系。

3.3. 使用微流控芯片筛选 EV71 允许细胞的可行性

为了评估使用细胞芯片筛选病毒宿主细胞的可行性，选择两种众所周知的病原体EV71和H1N1作为模型病毒。在正常情况下，当在适当的 MOI 下感染这些病毒时，允许培养的细胞表现出 CPE，例如由于病毒复制和释放而呈圆形、收缩或细胞质起泡。

为了证明 EV71、A549、Vero 和 RD 细胞的典型 CPE，以 1 × 104 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板中，并以 MOI 为 40 的 EV71 感染。所有三种细胞类型均表现出细胞病变变化，其中RD细胞在感染后24小时（hpi）表现出最显着的变化（补充图S1）。为了模拟用于 EV71 允许细胞筛选的临床或现场样品，将 A549、Vero 和 RD 细胞以与 96 孔板中相同的细胞密度接种到芯片上，并以 0.389 和 3.89 × 10−4 的低得多的 MOI 感染 EV71（图 5）。与未感染病毒的对照细胞（补充图S2）相比，在96孔板或芯片上分别在30（图5A）和48（图5D）hpi下培养的RD细胞上观察到典型的CPE。尽管 96 孔板中的 Vero 细胞在 MOI 为 0.389 时也显示出病变，但在两种培养模式下，RD 细胞在 30 hpi 时表现出最典型的 CPE（图 5A）。当使用RT-qPCR测量不同细胞系中EV71的病毒RNA拷贝数时，RD细胞对EV71增殖的支持最好，特别是在较低的MOI下（图5B和E）。具体而言，在MOI为0.389时，来自96孔板的A549或Vero细胞培养物中的EV71 RNA拷贝数大于来自细胞芯片的拷贝数（图5C）。这种差异可能是由于 96 孔板中的感染允许病毒颗粒和靶细胞上的受体与灌注芯片上的病毒颗粒和受体之间接触的机会更高。相比之下，在MOI为0.000389时，A549和Vero细胞没有观察到这种差异，这可以通过以下事实来解释：在超低MOI下，A549和Vero细胞中几乎没有发生EV71增殖（图5F）。在两种MOI中，RD细胞对EV71的增殖效率最高，96孔板和细胞芯片的EV71 RNA拷贝数无显著差异。因此，根据细胞芯片培养结果，可以选择RD细胞作为EV71的允许细胞系。这与RD细胞用于EV71培养的成熟使用一致，并与我们从96孔板（补充图S1）的结果相匹配，表明基于细胞芯片的允许细胞筛选可以用作传统板培养方法的替代品。

图 5.使用微流控芯片筛选 EV71 允许细胞的可行性。

此外，考虑到病毒感染后允许的细胞可能释放细胞因子，我们进一步测试了未感染或不太敏感的细胞系是否会受到最敏感细胞系的影响。我们调整了细胞系在微流控芯片上的排列顺序，并进行了筛选实验（图6）。结果表明，无论细胞系以何种顺序培养，RD细胞仍被“鉴定”为EV71的允许细胞系，支持允许细胞对非敏感或不太敏感的细胞系的潜在影响不会干扰使用微流控细胞芯片筛选病毒允许细胞的结果。

图 6.EV71感染在微流控芯片上以不同排列方式接种的不同细胞系。

3.4. 使用微流控芯片筛选 H1N1 允许细胞的可行性

为了比较基于细胞芯片和传统基于板的筛选，将 A549、Vero 和 MDCK 细胞接种在细胞芯片上或以 1 × 104 个细胞/孔的密度接种到 96 孔板中。流感病毒H1N1的培养需要TPCK处理的胰蛋白酶（TPCK-胰蛋白酶），因此将培养基优化为含有2%BSA和2μg/mL TPCK-胰蛋白酶的DMEM（补充图S3）。首先允许流感病毒 H1N1 以 12.3 的 MOI 感染这些细胞，以证明 H1N1 的典型 CPE。在24 hpi时，MDCK细胞显示出显着的CPE，而其他细胞仍保持正常的细胞形态（补充图S4）。

然后，在96孔板或微流控芯片上培养的细胞以0.012和0.00012的较低MOI感染H1N1，以模拟临床或现场样品进行H1N1允许细胞筛选（图7）。在MOI为0.012时，与未感染病毒的对照细胞（补充图S5）相比，在两种培养模式下（图7A）下，在72 hpi的MDCK细胞上观察到典型的CPE，这与MDCK细胞系对EV71允许的知识一致。然而，在MOI为0.00012时，没有一个细胞系显示出明确的CPE（图7D），这应该是由超低MOI引起的。为了进一步确认流感病毒H1N1可以在通过芯片培养“鉴定”为允许的细胞中复制，对培养物中的流感病毒H1N1 RNA进行了定量分析（图7B和E）。在 MOI 为 0.012 或 0.00012 的 A549、Vero 和 MDCK 细胞感染流感病毒 H1N1 后，以 72 hpi 收集培养物，并使用带有流感病毒 H1N1 聚合酶基因探针的 RT-qPCR 进行分析。在MOI为0.012时，病毒在两种培养模式下在MDCK细胞中复制（图7C）。虽然没有统计学上的显著差异，但在微流控芯片上培养的细胞中后代病毒的病毒RNA拷贝数略高于在96孔板中培养的细胞的病毒RNA拷贝数。然而，在MOI为0.00012时，在细胞芯片上的MDCK细胞中仅检测到低水平的病毒复制，而在96孔板的MDCK细胞中未检测到病毒复制（图7F），这表明与传统的基于平板的培养方法相比，细胞芯片可能对允许的细胞筛选更敏感。此外，我们还测试了未感染或不太敏感的细胞系是否会受到最敏感细胞系的影响。通过调整微流控芯片上细胞系的排列顺序，我们发现无论细胞系以何种顺序培养，MDCK细胞系都是H1N1的允许细胞系（图8）。这些结果进一步支持了使用细胞芯片筛选病毒允许细胞的可行性。

图 7.用微流控芯片筛选H1N1允许细胞的可行性。                                                             图 8.H1N1感染不同细胞系以不同排列接种在微流控芯片上。

4. 讨论

在这项研究中，已经制造了一种用于病毒培养的微流控细胞芯片，其工作原理如下。将多种候选细胞系接种在PDMS芯片的腔室中。当含有病毒的样本流过腔室时，允许病毒的细胞系将被感染，导致CPE。因此，可以确定新出现的病毒的允许细胞系，同时，可以通过分子生物学技术培养病毒以进行分离和鉴定。

微流控在先进材料、制造方法和在生物学和医学等各个领域的应用前景广阔，显示出巨大的潜力。在这里，通过使用强大的微流控技术，我们旨在开发一种用于病毒培养和分离的快速允许细胞筛选方法。为了使该方法简单而稳健，我们应用了微流控电池芯片的简单设计，并通过3D打印制备了带有PDMS的芯片。芯片上有多个串联的腔室，可以对病毒允许的细胞进行高通量筛选。此外，微流控细胞芯片可以集成到定制设备中，在高水平的生物安全控制下实现自动化高通量筛选和分离病毒。我们方法的优势不在于细胞芯片的制造方式，而在于它将提供下一代病毒分离和鉴定模式，效率更高，研究人员暴露于潜在传染性样本的风险更低。事实上，以前已经报道过使用微流控芯片进行病毒感染研究。Warrick等人使用微流控芯片测量被水泡性口炎病毒感染的宿主细胞的细胞基因表达（Warrick等人，2016）。Guo等人制造了由PDMS层组成的微腔，以监测病毒感染时的细胞动力学（Guo等人，2017）。然而，在这些研究中描述的微流控芯片上仅培养了单个细胞系，而这里报道的微流控细胞芯片实现了五个不同细胞系的同时培养。为了成为一种强大的细胞筛选和病毒分离工具，我们芯片上的细胞系数量仍有待增加。原则上，可以通过简单地增加细胞芯片上的腔室数量或设计平行芯片并分组或调整感兴趣的细胞系来扩展培养细胞系的类型。使用细胞芯片进行病毒分离时要考虑的另一个问题是，样本中可能存在两种或多种类型的病毒，并且在试图寻找特定传染病的病原体时被分离出来。在这种情况下，应通过测序或其他分子生物学技术鉴定目标病毒。

该细胞芯片将符合感染性样本操作中严格的生物安全要求。除了在筛选测定之前短暂暴露PDMS芯片外，细胞芯片设备在完全密封的条件下运行，可防止含有传染性病原体的培养基泄漏。此外，根据生物安全法规，该设备用于培养病毒时，应放置在合格的生物安全柜中。此外，微流控细胞芯片可以集成到未来符合生物安全协议的定制设备中，以便所有步骤（即细胞接种、病毒感染、灌注、循环等）都可以在生物安全控制下的完全封闭空间内进行，这有利于自动化操作并降低研究人员暴露的风险。

5. 结论

综上所述，通过预制芯片框架和定制PDMS芯片的快速组装，制备了一种用于细胞培养的简单微流控芯片。不同的PDMS芯片可以快速定制以满足病毒识别需求，并重新组装到这种微流控芯片中，这将有助于缩短从芯片设计到生产的时间。通过标准化培养条件，实现了多种常用于病毒增殖的代表性细胞系的培养。使用两种模型病毒 EV71 和 H1N1 的感染实验结果表明，微流控芯片系统通过支持在相应的已知宿主细胞系中开发典型 CPE，在识别病毒允许细胞方面效果良好。与传统的基于平板的病毒培养和分离方法相比，该细胞芯片系统具有更高的通量和更小的样品需求。此外，通过与必要的控制模块或设备集成，系统可以实现全自动，从而节省时间。本文所述的基于细胞芯片的培养系统为识别病毒允许的细胞和分离新出现的病毒提供了一种快速有效的方法，这将有助于对抗病毒性疾病。此外，这里制造的细胞芯片还可用于微纳米材料的细胞毒性研究、抗病毒药物筛选等。

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