微流控-磁学检测肿瘤外泌体研究取得进展

摘要

肿瘤来源的循环外泌体 （TDE） 正在被作为信息和非侵入性生物标志物。然而，定量检测TDE仍然具有挑战性。在此，我们构建了DNA四面体结构探针（TSP）介导的微流控磁检测系统（μFMS），为分析TDEs提供了一个快速、灵敏的平台。构建CD63适配体修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒（MNPs）形成磁性纳米报告探针（MNRs）。微流控芯片由DNA TSP修饰的醛基功能化的玻璃和蛇形微通道设计的PDMS层制成。模拟血清与PBS在TDE检测方面无显著差异，表明了所构建的μFMS系统在复杂生物系统中进行TDE分析的可行性。在成本、反应时间和操作程序方面，该μFMS有潜力被开发为癌症诊断和治疗的临床即时检测工具。

介绍

癌症目前人类的主要死因，严重危害人类健康。外泌体是大多数癌细胞分泌的杯状脂质双层膜囊泡（直径 30-150 nm），含有生物活性脂质、核酸和蛋白质货物。肿瘤来源的循环外泌体 （TDE） 通过癌细胞膜的向外膨胀释放，并且可以通过传递不同的信号分子来介导细胞间通讯，参与癌症中的各种生理和病理过程。越来越多的研究表明，组织和血清中有许多 TDE 可以被识别为早期诊断的癌症生物标志物。在 TDEs5 表面发现了多种膜蛋白，例如膜运输蛋白（Rabs、膜联蛋白）、热休克蛋白（Hsp 90、Hsp 70、Hsp60 和 Hsc70）和四跨膜蛋白（CD82、CD9、CD63、CD81）。其中，CD9 和 CD63 等四跨膜蛋白已被用作鉴定和分析 TDEs 的外泌体特异性标记物。

迄今为止，通过识别和结合外泌体表面的四跨膜蛋白，已经开发了许多 TDE 检测方法，包括荧光 、比色法、ELISA、表面等离子体共振 （SPR）、表面增强拉曼散射 （SERS） 和电化学。然而，由于检测性能相对较低、操作复杂、成本高等缺点，这些方法尚未在临床上得到应用。因此，开发一个灵敏、快速、自动化的TDE分析检测平台至关重要。、

最近，磁性生物传感器已成为强大的分子分析诊断平台，可测量包括 DNA、可溶性蛋白质、外泌体和细胞在内的靶标，具有固有的低背景噪声和生物介质中稳定的信号等优势。一般来说，磁性纳米材料（MNPs）、标记策略和磁力计是用于分子分析的磁性生物传感器的关键因素。MNP，包括铁氧体 MNP、铁芯 MNP 和多核 MNP，由于其独特的磁性和易于表面改性的特点，是传感应用的有吸引力的材料。其中，铁氧体MNPs因其高Msat（饱和磁化强度）值、低毒性等特点，在磁性生物传感器中得到更广泛的应用。粒径是影响磁性生物传感器检测性能的因素之一，流体动力学直径小于 50 nm 的 MNP 已被证明是理想的尺寸。磁性生物传感器的常见标记策略包括聚类测定、夹心测定和直接标记。夹心磁标记是使用亲和配体功能化MNP捕获生物靶标的最广泛使用的方法之一。亲和配体与固定在固体基板表面的二级亲和配体偶联，将MNP带到传感器表面进行磁信号检测。亲和配体（如适配体）可以识别具有高亲和力和特异性的靶标，已越来越多地用于与MNPs的偶联。 各种类型的磁力计已被应用于测量用亲和配体功能化MNP标记的生物靶标产生的磁信号，包括磁通门传感器、超导量子干涉器件（SQUIDs）、光泵浦原子磁力计（OPM）、 磁阻 （MR） 传感器、霍尔效应磁力计和感应线圈 。SQUID和OPM传感器具有很高的检测灵敏度，但它们在小型化和降低成本方面的潜力有限。磁通门传感器、磁阻传感器和霍尔传感器已用于 POCT 检测，但它们的检测灵敏度有限。基于感应线圈的磁性探测器具有易于小型化、集成化和低成本的优点。将感应线圈与差分电路相结合，可以大大降低噪声，提高磁探测器的灵敏度。例如，由感应线圈和差分电路组成的磁性传感器阵列能够以高灵敏度对磁性纳米粒子进行空间成像。

微流控芯片可以将实验室集成到单个芯片中，以实现快速和自动检测，通过提供高通量和灵敏度与低试剂消耗的有吸引力的组合，使检测和分析 TDE 成为可能。用于TDE检测的微流控芯片通常由上盖和底层基板组成。为了提高捕获效率，微观结构通常设计在上层通道中，以提供较大的表面积。下层通常用作固定亲和配体的固体底物，例如抗体和适配体。

近年来，自组装DNA纳米技术因其非凡的生物稳定性和生物相容性而备受关注。三维 DNA TSP 已被引入用于检测 DNA、microRNA、CTC 和 TDEs40。DNA TSPs通过共价结合，可以很容易地固定在固体底物上，具有优异的可控性和高精度的取向，可以减少非特异性吸附，调节抗体和适配体等亲和配体的分布和取向，从而提高检测灵敏度。

在这项工作中，我们开发了一种微流控磁检测系统（μFMS），通过将MNP、微流控芯片和基于感应线圈的磁探测器与DNA TSPs相结合，用于快速灵敏地检测TDE。CD适配体修饰的 MNP 可以将捕获 TDE 的事件转换为磁信号，并以电压信号的形式输出。采用带有差分放大电路的感应线圈来消除大部分背景噪声。DNA TSP被引入并固定在醛修饰的载玻片上（图S3），作为支架形成TDEs的捕获结构。带有蛇形微通道的PDMS上层与载玻片紧密结合，并与磁性检测装置集成。对μFMS进行了研究和优化，以自动、灵敏和快速分析从U2细胞系中提取的TDE。

结果与讨论

μFMS的工作原理

μFMS通过三明治样免疫测定法检测TDE。DNA TSP通过胺和醛基之间的共价偶联固定在醛官能化载玻片上（图1a）。将SA和生物素-抗CD9依次注射到微通道中，形成DNA TSPs/SA/生物素-抗CD9结构。TDE和MNR溶液通过入口泵入微流控芯片。在流经蛇形混合微通道时，两种溶液混合并发生反应。然后，DNA TSPs/SA/生物素-抗CD9捕获结构、TDEs和MNRs之间形成夹层结构（图1b）。之后，使用PBS冲洗MNR，然后将其收集到Eppendorf管中。由于我们使用的磁传感平台比在芯片上更能测量 MNR 产生的基于体积的磁信号，因此我们使用磁力计磁探测器测量了总 MNR（Voltage total MNRs）和冲洗后的 MNR（冲洗后的电压 MNR）的电压输出信号。通过计算总电压MNRs和冲洗后的电压MNRs之间的差值，获得了片上捕获的TDEs（片上电压MNR）的电压输出信号。

图1

提取的 TDE 的表征

透射电镜观察从U251细胞系中提取的TDEs的形态。结果表明，TDEs具有典型的杯形膜结构，平均尺寸为100 ~ 150 nm（图2a），这与之前的报道一致。DLS结果表明，TDEs的平均尺寸在131 nm的峰值处（图2b），证实了我们制备的样品中存在TDE。WB 显示了 CD63 和 CD9 标记蛋白的透明条带（图 2c），这表明 CD63 和 CD9 在 TDE 表面表达。NTA分析的TDEs大小分布和浓度显示，从U251细胞系中提取的TDEs浓度为1.98×1011颗粒/mL，平均大小为131 nm（图2d），这与DLS结果一致，证实了我们制备的样品中存在TDEs，可用于进一步研究。

图2

DNA TSP 和 MNR 的表征和优化

进行SDS‒PAGE分析，以证明通过PCR进行的DNA四面体。如图3a（左）所示，与2个单链DNA（A，B）、2个双链DNA（AB，CD）、2个三链DNA（ABC、BCD）、1个四链DNA（ABCD）和1个五链DNA（ABCDL）的图像相比，凝胶电泳图像表明DNA TSPs移动速度更慢，证实了DNA TSPs的成功形成。通过AFM的DNA TSPs的表面形态如图3a（右）所示。AFM图像中的三角形表明DNA TSPs组装成功。

图3

TEM证实了MNRs和TDEs相结合的可行性。如图3b所示，在MNRs表面观察到具有典型磷脂双层膜结构的TDEs（用红色箭头表示），表明MNRs成功捕获了TDE。

适配体与MNPs的结合取决于MNPs上的羧基与CD63适配体的氨基之间的脱水缩合。透射电镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）光谱和DLS观察结果证实了MNPs与CD63适配体之间的偶联。如图3c（a）所示，在MNPs的FTIR光谱中观察到580 cm−1 （Fe-O）和1642 cm−1 （C = O）处的两个峰（黑色）。与CD63适配体孵育后，在MNRs（黑色）的FTIR光谱中清晰地观察到1378 cm−1 （C-N）、1538 cm−1 （N-H）、2850 cm−1和2920 cm−1（烷基链中的CH2）处的另外四个峰。如图3c（b）所示，DLS揭示的MNPs和MNRs之间的尺寸变化表明，MNRs的直径（276.9 nm）大于单分散MNPs（52.5 nm）。透射电镜显示，图3c（c）中的MNRs发生了轻微的聚集，而图3c（d）中的MNPs表现出良好的单一色散性。以上结果表明，MNP表面可以与CD63适配体成功偶联。

μFMS的构建和TDE检测实验条件的优化

微流控芯片的目的是固定TSP和捕获TDE。PDMS蛇形结构的尺寸为500 μm宽和120 μm深（图S1），与直线结构（扁平芯片）相比，提供了更大的表面积（图S2），可以提高TDE的捕获效率。此外，氨基修饰的DNA TSPs通过胺和醛基之间的共价偶联很容易固定在醛官能化载玻片上。

μFMS的性能通过磁性纳米颗粒溶液的浓度梯度进行校准（图S5）。结果表明，产生的电压信号与标准磁性纳米粒子的浓度具有良好的线性相关性，线性回归方程表示为Y = 0.2091X + 0.00283 （R2 = 0.9997），证明所构建的μFMS系统能够定量检测MNR捕获的TDE。

使用DNA TSP修饰的蛇形芯片和扁平芯片证实了μFMS中蛇形芯片对TDE检测的有效性。蛇形芯片组的电压信号高于扁平芯片组，这意味着芯片上捕获的TDE更多（图S6A）。

使用醛修饰的载玻片基板制成的微流控芯片验证了基于DNA TSP的支架对TDE检测的有效性，该芯片由双链DNA（dsDNA）和TSP DNA固定的醛修饰载玻片基板组成。结果表明，DNA TSP组比dsDNA组具有更高的电压信号，表明DNA TSPs具有更高的捕获效率（图S6B）。

TDE和MNR之间的孵育时间会影响分析过程。较短的孵育时间会导致 TDE 无法完全与 MNR 结合。较长的孵育时间可能会加重适配体对MNPs的非特异性吸收。μFMS中的流速会影响TDEs和MNRs之间的结合效率，低流速会增加样品处理时间;然而，高流速会导致 TDE 和 MNR 之间的孵育不足。为了通过μFMS获得更高的TDEs检测性能，优化了孵育时间和流速。

如图4a所示，当TDE和MNR之间的孵育时间为10、30、60、90和120 min时，60 min可以达到最高的SNR（信噪比），这意味着微流控芯片上的TDE捕获效率最高。因此，选择60 min作为最佳孵育时间。

图4

如图4b所示，在最佳孵育时间（60 min）下，随着流速的增加，信噪比信号增大，达到最高值并开始减小。在 20 μL/min 的流速下实现的最高 SNR 意味着可以获得 TDE 的最高捕获效率。因此，选择20 μL/min作为最佳流速。

设计梯度实验来优化结合在MNPs上的CD63适配体浓度。如图4c所示，当CD63适配体浓度从0.05 μM增加到3 μM时，CD63-FAM-MNPs的荧光强度逐渐增加，并在浓度为3 μM时变得稳定，这表明负载在MNPs表面的CD63适配体浓度已达到饱和。因此，选择3 μM作为本实验的最佳适配体浓度。

用于TDE的μFMS的分析性能

优化用于TDE检测的μFMS的实验条件后，在微流控芯片上分析从PBS溶液中不同浓度的U251细胞系中分离得到的TDE。随着TDE浓度从1.98 × 103增加到1.98 × 107 particles/mL，MNRs的信噪比也随之增加（图5a）。MNRs的信噪比与TDEs浓度对数之间的曲线拟合显示出良好的线性关系（图5b）。相关方程表示为SNR = 0.11219lg[TDE]-0.03004 （R2 = 0.9965）。由于浓度为 1.98 × 103 个颗粒/mL 时的 SNR 明显低于阈值，即空白信号加上三个标准偏差 （3 SD），因此获得了 1.98 × 103 个颗粒/mL 的检测限 （LOD）（图 5b，插图）。

图5

我们的μFMS方法和其他报道的用于TDE检测的微流控平台如表1所示。与大多数其他工作相比，我们的μFMS具有易于小型化、集成化和低成本等优点，可以满足临床POCT的要求。此外，MNPs、DNA TSPs和微流控芯片与磁性生物传感器的结合，确保了该方法能够实现灵敏和快速的检测能力。检测复杂生物样品中的外泌体

为了验证μFMS对TDEs的临床实用性，我们通过模拟临床血清样本评估了μFMS的检测性能。从PBS溶液中U251细胞系中提取的TDEs与50%FBS和80%FBS模拟血清样品的SNR没有差异（图6），这意味着我们构建的μFMS可能是从真实临床样本中检测TDEs的潜在分析方法。

图6

回收率还用于评估制备的μFMS用于临床样本的可行性。所得结果分别为100%、106.83%和111.38%，表明我们的μFMS在复杂环境下对TDEs的检测性能良好。

结论

在这项工作中，我们开发了一种 DNA 四面体介导的 μFMS，用于具有高灵敏度和特异性的 TDE 片上检测。我们设计并制造了一种以PDMS为上层，玻璃基板为下层的微流控芯片。在玻璃衬底上合成和修饰DNA四面体纳米探针以捕获TDE。将微流控芯片与包含感应线圈的磁探测器和差分放大电路相结合。在验证了DNA四面体纳米探针和微流控芯片在μFM中测量TDEs的可行性后，确定了μFMS在优化条件下的检测性能，线性动态检测范围为1.98×103–1.98×107颗粒/mL，检测限为1.98×103颗粒/mL。我们证明模拟血清系统和PBS缓冲液对TDEs的检测结果没有显著差异。与其他TDE检测策略相比，我们的μFMS在检测灵敏度和时间方面表现出很大的优势。因此，我们开发的μFMS系统可以为无创液体活检提供非凡的选择，并有可能成为有用的POCT工具。

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