PET降解微生物的荧光活化液滴分选

摘要

迫切需要能够分解聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）等合成塑料的酶。尽管如此，由于缺乏检测和分类具有巨大多样性和丰度的环境微生物的技术，瓶颈仍然存在。在这里，我们开发了一种荧光激活液滴分选 （FADS） 管道，用于高通量筛选 PET 降解微生物或酶 （PETases）。该流程包括三个步骤：封装单细胞的液滴的产生和孵育，皮秒注射二苯甲酸荧光素（FDBz）作为荧光探针，以及筛选液滴以获得PET降解细胞。我们表征了与该方法相关的关键因素，包括区分PETase与其他酶的特异性和敏感性。然后，我们优化了其性能以及与环境样品的兼容性。该系统用于筛选PET纺织厂的废水样品。我们成功地从九个不同的属中获得了PET降解物种。此外，来自分离株内生Kineococcus Un-5和表皮葡萄球菌Un-C2-8的两种假定的PETase被遗传衍生，异源表达，并初步验证了PET降解活性。我们推测，FADS管道可以被广泛用于在各种环境中发现新的塑料降解微生物和酶，并可用于使用合成生物学的降解酶的定向进化。

PET降解微生物的单细胞筛选

介绍

合成塑料已成为现代生活中不可或缺的一部分。塑料污染问题正在加剧，尤其是在 COVID-19（2019 年冠状病毒病）大流行爆发之后。由于其优异的化学耐久性和热性能，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）已成为制造瓶子和纤维的主要热塑性树脂。PET废物的控制、回收和处理是一个巨大的挑战。因此，人们非常关注微生物对PET的生物降解，以解决PET废物引起的问题。只有少数微生物PET降解酶（PETases）被报道，包括来自Thermobifida的角质酶样酶和来自南极念珠菌的脂肪酶或酯酶和脂肪分解耶罗菌。已发现源自Ideonella sakaiensis的PETase将PET降解为对苯二甲酸单（2-羟乙基）酯（MHET）和对苯二甲酸（TPA）。DuraPETase、EXO-PETase和叶枝堆肥角质酶 （LCC）最近通过基于结构的蛋白质工程开发，以提高催化活性和热稳定性。尽管取得了所有这些突破，但人们可以预期，基于自然界中微生物的巨大遗传多样性和丰度，尚未发现更多的微生物PETase。然而，从环境中发现新的PETases既费时又费力。它涉及富集、筛选、培养、酶表达和活性验证。由于当前分选技术效率低下，新型降解微生物和酶的筛选仍然是一个缓慢而复杂的过程。塑料生物降解的传统测量包括塑料失重、机械性能或化学结构的变化以及二氧化碳排放，但这些可能需要长达几个月的时间。已经开发了用于PET薄膜水解的高效液相色谱（HPLC）或吸光度测定，但尚未扩大到环境微生物群落或大规模突变文库的高通量分析。先前的一项研究使用4-氨基安替比林（4-AAP）在酶板筛选中模拟PET聚合物。然而，由于缺乏快速、特异性、灵敏和定量的检测和分选方法，仍然难以有效地评估PETases的活性。

为了克服筛选功能微生物或酶的瓶颈，已经开发了各种高通量筛选技术。其中，引入微流控荧光激活液滴分选（FADS）可显著简化操作，提高分选效率和灵活性，并降低大型文库筛选的成本。FADS 技术正在迅速发展和适应，以满足不同微生物的分类。引入同心分选通道设计以施加延长的介电泳力，从而在分选过程中实现较大的挠度并提高可靠性;顺序电极阵列旨在允许以更高的通量分选大液滴。FADS已成功应用于筛选脂肪酶/酯酶，DNA/XNA聚合酶，纤维素酶和NAD（P）依赖性氧化还原酶通过结合高灵敏度和特异性的荧光酶测定。在此，我们开发了一种基于 FADS 的方法，用于加快 PETase 的搜索，然后通过基准 PETase 验证其性能。我们用它来从PET纺织厂的废水中获得PET降解微生物，并评估了用于PET降解活性的假定新PETase。我们设想，本研究中开发的FADS管线可以广泛应用于PET降解微生物和酶的发现。

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