外泌体的高效分离和富集的双切向流过滤微流控装置

最近，外泌体因其在疾病发展中发挥的重要作用而被公认为重要的疾病生物标志物。然而，从复杂体液中高效分离和富集外泌体继续阻碍着外泌体临床应用的研究和应用。在这项工作中，我们开发了一种基于双切向流过滤的微流控装置，用于从细胞上清液和人血清中分离外泌体。微流控装置包含两个模块。每个模块包括两个聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 板，具有对称的蛇形通道和一个孔径为 200 nm 或 30 nm 的纳米多孔膜，用于分离较大的囊泡、外泌体和游离生物分子。对称蛇形通道中的双切向流过滤设计大大增加了滤液与纳米多孔膜的接触面积，从而提高了分离效率，防止了膜的堵塞。与超速离心（UC）标准分离方法相比，基于微流控芯片的外泌体分离（Chip）具有仪器成本更低、耗材成本更低、时间更短（<120 min）、纯度更高（82.8%）、回收率显著提高（77.8%）等优点。此外，由于无标记分离，微流控装置收集的外泌体可直接用于蛋白质组学分析等下游分析。该芯片从临床不同疾病患者血清中分离出的外泌体的蛋白质组学分析结果显示，与UC分离的外泌体相比，该芯片具有更丰富的疾病相关信息，证明了该芯片在未来临床上具有良好的实用性。

细胞外囊泡是具有磷脂双层结构的囊泡，几乎可以由所有类型的细胞分泌，根据其大小和形成途径，大致可分为外泌体、微囊泡和凋亡小体三类。在这些囊泡中，外泌体具有狭窄的尺寸分布，直径范围为 40 至 200 nm。外泌体广泛存在于生物体液中，参与各种生理和病理过程，在细胞间通讯过程中发挥重要作用。肿瘤来源的外泌体是肿瘤发生和转移的有效介质，携带有关肿瘤细胞的特定分子信息，如蛋白质、核酸、脂质体和细胞内代谢物。此外，越来越多的研究采用外泌体作为载药载体来治疗疾病，因为它们具有良好的生物相容性和较高的治疗效率。因此，外泌体在临床诊断和疾病治疗中都是很有前途的工具。解决一些基本的技术问题，如外泌体的分离、富集、分子表征和工程化，是这些应用中的重要任务。

然而，生物体液的组成通常非常复杂。例如，多种蛋白质、核酸、囊泡和代谢物共存于人血清中。因此，从人血清中准确提取外泌体是一个巨大的挑战。基于外泌体的密度、形状、大小和特异性表面蛋白表达，已经发展出许多分离方法，如基于密度的分离技术、基于大小的分离技术、基于免疫亲和捕获的技术、外泌体沉淀和基于微流控的分离技术。其中，无标记分离方法是近年来外泌体分离的趋势，避免了标记剂的引入，减少了潜在的污染物，对外泌体的下游分子表征或工程化具有重要意义。到目前为止，超速离心一直是无标记外泌体分离的金标准。然而，由于其回收率低、纯度低、操作繁琐且需要昂贵的设备，难以满足临床需求。尺寸排阻色谱（SEC）是另一种以高产量和高纯度快速分离外泌体的宝贵技术。然而，应使用大量的缓冲溶液从分离柱中洗脱外泌体，这导致收集的外泌体浓度相对较低。如果需要下游分析，可能需要在UC的帮助下富集外泌体。近年来，微流控技术显著推进了纳米级颗粒的无标记分离。到目前为止，已经开发了许多用于分离外泌体的微流控平台，例如基于粘弹性、声学、惯性、电和离心力的微流控平台。使用微流控技术进行外泌体分离仍存在一些紧迫的问题，如器件制造的复杂性、成本仍然很高、需要特殊设备等。最近，基于膜过滤的微流控装置被开发出来，通过纳米多孔膜的尺寸筛分，将外泌体与体液中的其他成分直接分离。这些设备相对容易制造，制造和运营成本低。更重要的是，外泌体分离效率相对较高，产率较高，操作时间短，具有巨大的临床应用潜力。然而，大多数基于膜过滤的微流控装置在外泌体分离中使用垂直过滤，导致系统中压力过大并容易堵塞。最近，Qiao等人设计了一种基于切向流过滤的微流控芯片，用于从人血浆中分离外泌体[26]。切向流设计避免了垂直过滤压力大、易堵塞等问题，蛇形通道设计允许液体与滤膜接触面积更大。然而，在注入微流控装置进行外泌体分离之前，仍应使用高速离心对血浆样品进行预处理。该装置只能用于从蛋白质污染物中分离外泌体，这严重限制了该装置的广泛应用。

肿瘤来源的外泌体携带来自母体细胞的丰富信息，包括四跨膜蛋白、细胞信号分子、致癌蛋白、伴侣蛋白、细胞骨架、遗传物质、蛋白酶和抑癌基因。对于癌症患者来说，肿瘤细胞分泌的外泌体将携带丰富的疾病相关信息。肿瘤细胞与肿瘤分泌的外泌体之间的相关性将成为癌症诊断和后续治疗的重要基石。蛋白质是疾病发展中的主要功能分子。因此，更好地了解外泌体中的蛋白质组成对于癌症的评估至关重要。蛋白质组学是揭示蛋白质组成、结构和活性的有用方法。使用蛋白质组学分析外泌体蛋白有望大大加深我们对外泌体和疾病的理解。

在此，我们设计了一种基于双切向流过滤的微流控装置，用于外泌体分离和富集。使用孔径为 200 nm 和 30 nm 的多孔膜分选出 30 至 200 nm 之间的囊泡，可以分离和纯化来自常规外泌体溶液（细胞培养上清液和人血清）的外泌体。比较了本方法与UC方法的回收率、纯度、设备和耗材成本以及操作时间。此外，通过蛋白质组学对两种方法分离的肝脏相关疾病患者血清中的外泌体进行分析和比较，实现了对不同疾病类型的区分和可能的治疗靶点的筛选。

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