用于丝状真菌的抗真菌分析的液滴微流控平台

杀菌剂在农业中广泛用于控制真菌病原体，这些病原体对植物产量和质量产生重大经济影响。传统的抗真菌筛选技术，如水琼脂和 96 孔板，基于费力的方案和批量分析，限制了单孢子水平的分析，并且非常耗时。在这项研究中，我们提出了一种基于液滴的微流控平台，可以对丝状真菌链格孢的单个孢子进行抗真菌分析。开发了一种基于液滴的活力测定法，允许液滴内单个互花米孢子的萌发和菌丝生长。在24 h的时间内证明了活力，并使用Kunshi/Tezuma作为抗真菌剂进行了抗真菌筛选。将基于液滴的抗真菌分析的疗效结果与常规方案的结果进行比较和验证。基于液滴的平台评估的抑制百分比与其他两种方法获得的抑制百分比相同，Pearson相关性分析显示三种检测之间的高度相关性。综上所述，这种基于液滴的微流控平台为分析杀菌剂抗性发展以及其他抗菌剂甚至拮抗真菌的组合筛选提供了广泛的潜在应用。

植物病原真菌每年破坏三分之一的粮食作物，造成经济损失并影响全球贫困。在这些植物病原真菌中，链格孢菌会引起马铃薯作物的褐斑病。褐斑病，俗称“另一种早疫病”，是马铃薯的一种重要病害。症状包括出现在叶子背面的小圆形棕色病变。该病有可能使产量降低多达 30%，当病害得不到控制时，还报告了高达 70-80% 的损失。在储存过程中，互花米草会在块茎上造成黑坑，导致收获后损失 10%。几种杀菌剂用于控制疾病、提高生产力和延长收获作物的储存寿命。大量使用特定地点的杀菌剂会导致互花米草和各种其他真菌产生杀菌剂抗性，这需要发现新的抗真菌剂。新杀菌剂的发现和开发面临着巨大的挑战，包括 （a） 筛选大型抗真菌候选药物库以评估其功效、植物毒性和其他可能的影响，（b） 广泛的研究推动的产品开发成本高昂，以及 （c） 复杂的体外和体内实验。一种新的作物保护产品大约需要 10 年时间，开发成本约为 2.6 亿美元。对于抗真菌筛选，使用各种常规技术，包括琼脂平板和 96 孔平板。然而，不同的分析方法可能会导致不同的灵敏度，影响测试结果的可靠性和可用性，从而影响“真正的命中”作为针对特定真菌的抗真菌剂的选择。敏感性的差异可能会根据观察到的杀菌剂反应得出有偏差的结论，并取决于所使用的方案。此外，多孔平台的一些主要局限性是所需的昂贵实验试剂和耗材的数量、耗时费力的方案以及封闭的系统设计。经典方法在单孢子分析方面也存在局限性，并且处理和可重复性等特殊困难可能导致实验运行中观察结果之间的相当大的差异。因此，重要的是要建立一种新的经过验证的标准化抗真菌分析方法，以克服这些限制。

微流控方法的进步推动了寻找专门针对抗真菌剂的新分子靶点的搜索。在过去的二十年中，微流控技术一直是人们关注的焦点，因为它与传统检测相比具有优势，例如（a）将台式实验室缩小到芯片，（b）试剂消耗低，（c）高通量（HT）分析，（d）缩短分析时间，（e）监测高空间和时间分辨率，（f）观察许多细胞的动态行为（g） 提供有关异质微生物群体中细胞间变异的信息 和 （h） 研究真菌之间的菌丝相互作用。这些优点使微流控设备成为抗真菌筛选和分析的多功能工具。在不同的微流控方法中，基于液滴的微流控技术已成为传统微量滴定板方法的一种越来越有趣的替代方案，用于真菌的酶促HT筛选。这些方法可以为单孢子封装提供另一种方法，并有可能成为大规模抗真菌分析的有力工具。尽管基于液滴的微流控具有快速、经济高效的HT筛选的潜力，但目前尚未用于常规抗真菌测试和分析，这很可能是考虑到技术困难，例如不同的培养表面、减少的培养基体积以及微流控工具所代表的培养基交换速率和方法大不相同对于大多数有经验的植物生物学家来说。重要的是，将植物病原真菌的单个孢子封装到液滴中，被视为微反应器，可以防止恶劣的外部环境条件，使孢子的物理和化学分离成为可能，并减少被外来生物污染的机会。此外，通过向液滴中注射不同的试剂选择性地提供营养物质或抗真菌剂，通过增强对微环境的动态控制，可以在单个孢子水平上观察杀菌剂分子机制，从而获得对杀菌剂分子机制的新见解。如今，有各种成熟的封装单个孢子的技术，包括逐层沉积、溶剂蒸发和界面聚合。然而，这些技术使用各种细胞毒性化合物、腐蚀性化学品或有机溶剂，这会危及封装生物的活力。因此，基于液滴的方法应对这些挑战并使用生物相容性试剂可能有可能逐步过渡到单孢子分析，以进行常规测定的抗真菌筛选，这最终可能会彻底改变杀菌剂的开发方式以及如何控制真菌中的杀菌剂耐药性。

本研究的主要目的是建立一种简单的微流体装置，能够 （a） 封装真菌的单个孢子，（b） 进行抗真菌分析，以及 （c） 量化基于梯度的抗真菌剂量反应。本文描述的平台允许在密闭的微环境中评估抗真菌剂对孢子萌发的直接影响，具有高可重复性，并且能够使用广泛可访问的显微镜图像分析对孢子萌发进行定量。我们的设计结合了微米级的陷阱，这些陷阱限制了封装的孢子，允许它们随着时间的推移通过明场显微镜进行个体可视化和评估。为了验证使用微流控平台的抗真菌评估结果，我们还使用两种常规方法进行了评估实验，即水琼脂 （WA） 和 96 微量滴定板。在本研究中，我们展示了具有精确流体控制的基于液滴的抗真菌分析平台的设计和表征，作为严格、可重复、单孢子包封和抗真菌分析的新基准。

结果

将单个孢子封装在微流体液滴中

通过将一层聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 粘合到载玻片上，将微通道压印到表面 50 μm 上，构建了单孢子封装的装置。通过将结构化的PDMS表面粘合到载玻片上，创建了通道和两个入口，第一个用于油（含表面活性剂），第二个用于孢子悬浮液（半强度PDB）。半强度PDB用于避免孢子萌发的变异性。喷嘴的尺寸为50μm，液滴是通过用两股含有表面活性剂的氟化油流对水流进行流动聚焦而产生的（图2a）。所设计的芯片能够在油中PDB中产生单分散液滴，并在PDB中封装互花格孢的单个孢子（图2a，b）。为了设定单孢子包封的最佳条件，测试了油和孢子悬浮液的各种压力。发现 100 μm 的液滴大小最适合单个互花米孢子的萌发，同时在孵育 24 小时后为菌丝生长留出足够的空间（图 4b、c）。将单个孢子封装在液滴中允许支链菌丝网络在液滴中生长长达 24 小时。包封后4 h和24观察生长。包膜的孢子在萌发、细胞壁发育或菌丝生长方面没有表现出任何异常（图2c）。将液滴从芯片外收集在装满油和表面活性剂的小瓶中。液滴尺寸系数变化（CV）为1%（即单分散液滴）。CV是表示液滴单分散性或多分散性的系数变化。值得注意的是，液滴的大小和频率通常取决于所用液体的压力、流速和粘度。图2d显示了施加在两种液体上的压力所产生的液滴大小。

用于片上抗真菌分析的微流控平台

抗真菌分析平台包括OB1流量控制器、管路、连接器、50 mL聚苯乙烯管、聚碳酸酯（PC）微流控芯片（疏水通道）和用于观察的光学显微镜（图3a）。OB1 压力控制器用于以高通量可靠地产生单分散液滴 （CV < 3%）。由于PDMS可能吸收小疏水分子，如孢子衍生的生物分子和药物，这些芯片用于对系统中的孢子进行活力测定，并优化液滴尺寸以进行封装。对于最终的微流控分析平台，使用了由PC制成的芯片（图3b）。市售芯片由两个不同的部分组成：（1） 液滴制造器和 （2） 液滴存储位置（总共 2261 个）。滴剂制造器允许用特定浓度的杀菌剂封装单个孢子（图 3c）。微流控芯片的结构旨在通过合并两股水流来通过流体动力流聚焦产生液滴：一种携带孢子悬浮液，另一种携带特定浓度的杀菌剂。含有孢子悬浮液和抗真菌剂（kunshi）的培养基PDB分别以200 mbar泵送，同时以210 mbar HFE7500浓度泵送氟化油+ 1%v/v表面活性剂，微调压力允许水性流体1：1混合。将得到的 100 μm 大小的液滴捕获在芯片上的特定存储位置孵育 24 小时 （Fig. 3d–g）。诱捕器允许在孵育4小时和24小时时观察每个孢子的可视化。每小时产生103个液滴（直径为100μm）×液滴的通量为5.4个（油压=210mbar，孢子悬浮压力=200mbar，杀菌剂压力=200mbar）。根据泊松分布定律，每滴平均孢子数（λ）为0.01，单孢子滴为70个（n=12），占有率为0.03%。具有两个孢子的液滴数量为8个（n = 12），占有率为0.003%。无孢子的液滴数量为2183个（n = 12），空液滴占有率为0.965%。在t = 0 h（100μm），t = 4 h（99.97μm）和t = 24 h（99.47μm）时计算液滴大小。在实验过程中，通过提供培养基和无菌环境，在液滴内保持最佳生长条件。

该平台通过将单个孢子封装在具有特定浓度的坤孢的液滴中，评估坤石对链格孢菌孢子萌发的抗真菌功效。总共使用了七种不同浓度的昆氏，范围从0.015到6μgμL−1。6 μg μL−1 的剂量在孵育 4 h 和 24 h 后萌发最多减少 98.6%，显著高于对照组 （P < 0.05）。在0.015 μg μL−1浓度下，孢子萌发减少最少（6.9%），显著高于对照组（P < 0.05）。与对照组相比，所有浓度（孵育后4小时和24小时）均表现出显著高的抑制百分比（P < 0.05）（图4a，b）。此外，每个浓度的4和24 h时间点之间的抑制百分比彼此之间没有显着差异（P < 0.05）。

与杀菌剂孵育4 h和24 h后，坤石对互花米草孢子萌发的抗真菌活性表现为EC50（中位抑制浓度）。资料显示，坤石对链格孢菌孢子萌发具有剂量依赖性抗真菌活性。在4小时和24小时的时间点，EC50的总值范围为0.125至0.25μgμL-1（表1）。

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