Sehyun Shin：利用微流控中DNA水凝胶的形成实现传染性病毒的快速分子诊断

作者：张洋子

当传染性病毒传播时，最好的解决方案是快速准确地检测出传染因子并分离载体以防止进一步传播。因此，开发合适的快检工具，迅速筛查具有各种病毒综合征类型的患者并根据所鉴定的病毒采取必要的措施则是十分必要的。

目前，快速免疫分析已经解决了基于抗体的酶联免疫测定方法的时间问题并提高了便利性，但仍然具有抗体依赖性问题并且准确性差。同时，高灵敏度、高准确度的聚合酶链式反应（PCR）已经成为实验室环境中最广泛使用的检测方法。然而，该检测系统依赖于PCR仪实现升降温且检测成本较高,不适合在现场及发展中国家普及。因此，考虑到将等温扩增技术，如滚环扩增反应（Rolling circleamplification, RCA）集成到微流体平台中，可以有效解决上述问题。

基于此，韩国高丽大学的Sehyun Shin教授及其团队研制出一种新的微流体装置（图1），该装置主要由一个样品池、一个填充有琼脂糖微珠的多通道以及一个注射器三部分组成。用于填充的琼脂糖微珠已提前修饰上进行RCA反应的引物，当含有病原体靶标物质进入混合有RCA反应体系及墨水的样品池，首先与其中的模板结合，形成封闭的哑铃型RCA模板，随后逐渐流入对应的微通道内，与引物杂交后开始RCA反应，一段时间后，充分扩增的DNA产物彼此缠结在微珠表面形成DNA水凝胶，促使微珠表面积显著增加，相应的横截面流动面积减小，从而阻止液体在微珠之间进一步流动（图2）。注射器用于产生具有死体积的可变真空压力。由于与样品体积（25 μL）远小于死体积（4.1mL），因此整个检测过程中新产生的真空压力不会发生显著变化，从而不会对多通道之间造成任何干扰。

图1 （a）实验装置；（b）微珠填充微通道的示意图；（c）微珠填充微通道内显微镜图像。

图2  利用琼脂糖微珠通过RCA反应形成DNA水凝胶示意图

研究团队首先对微珠的选择以及引物修饰效果进行了优化。如图3所示，首先将引物分别修饰在聚苯乙烯微珠和琼脂糖微珠，经过洗涤后，再加入修饰有荧光基团FAM的探针，使其与修饰在微珠上的引物互补配对，再次洗涤后通过荧光显微镜进行观察。对二者的荧光强弱可以明显看出，引物修饰在琼脂糖微珠上效果更好。此外，还使用分别修饰有两种引物的微珠进行RCA反应，琼脂糖微珠表面获得的水凝胶量更多，再次证明其较聚苯乙烯微珠更适用于本实验。经分析，琼脂糖微珠具有一定的弹性，装载进入微通道离心后会发生形变，使微珠能够最大化的充满整个通道内，有助于RCA反应生成的产物更快达到阻隔染料前进的目的。

图3  验证引物分别固定在聚苯乙烯微珠和琼脂糖微珠上

随后，确定了这一装置检测病原体的检测范围。如图4a所示，当样品中没有靶标时，不会促发RCA反应，因此，在微通道内没有任何堵塞，此时的基本流动阻力为3.65 kPa，即检测的背景值。将垂直轴上的压力定义为打破微通道内微珠间形成DNA水凝胶的临界压力。当靶标病原体以0.01 pM的浓度存在时，通过微通道所需的压力略微增加，但不具有统计学意义（p?<?0.05）。进一步升高病原体浓度至0.1 pM时，临界真空压力与对照组出现显著差异（p <0.05）。随着浓度继续增大，与对照组的差异更为明显。由此，首先计算出吸入压力为5.06 Pa，即作为截至临界压力，并在此基础上建立了浓度与压力的校准曲线，计算出检出限LOD为0.019 pM。

将病原体DNA浓度固定在1 pM，微通道内微珠填充管的长度固定在20 mm的条件下进一步优化了RCA反应的时间。如图4b 所示，在RCA反应15 min后出现显著差异（p<0.05）。20分钟后，临界压力与对照组（0分钟）存在显著性差异（p <0.001）。各种病原体的LOD和检测时间相似。经分析，这些通过肉眼检测获得的实验结果与之前的相关研究报道比较，最短时间从2小时减少到仅需15分钟。

图4 （a）病原体DNA浓度与施加压力的关系；（b）孵育时间与施加压力的关系（*:p?<?0.05, **: p?<?0.001）。

在优化好的条件下，将研制的装置用于实际样品可行性检测中。如图5所示，样品1含有埃博拉病毒和寨卡病毒病原体，因此墨水仅通过相应的通道。相类似的，包含登革热和MERS病毒的样品2也在此对应的微通道内发生RCA反应形成DNA水凝胶实现检测。因此，本系统可以选择性地和灵敏地可视化检测混合传染性病毒样品。

图5 使用微流控芯片进行实际样品的检测的结果（a）样品1：登革热和MERS；（b）样品2：埃博拉和寨卡病毒。

点评：

1. 该团队开发了一种微流控装置，通过在微通道中填充的数千个微珠表面上形成DNA水凝胶，阻断珠子之间形成的流动路径，将靶标浓度与装置内的压力建立关系，实现15分钟内轻松准确并且无需使用任何电动仪器或设备即可检测多种传染性病毒。

2. 研究中巧妙地设计了哑铃型模板用于RCA反应，且将RCA用于微流控快速检测装置中的反应时间大大缩短，在现场筛查中有望进一步应用。

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