微流控PCR, QPCR, RT-PCR & QRT-PCR

1.微流控PCR, QPCR, RT-PCR & QRT-PCR简介

最常见的DNA分析是聚合酶链式反应（或PCR）和定量聚合酶链式反应（qPCR）。两种方法都包含在DNA序列的特定指数扩增中。

PCR和qPCR具有众多应用，例如DNA测序。直接PCR应用之一显然是克隆DNA序列（例如基因）。

它还可以帮助检测到低量的DNA（例如，用于病原体检测，如细菌或病毒）。

就一般生物分析而言，微流控为PCR分析提供了许多优点：

①整个生物过程整合并因此被最终用户简化；

②高通量，多重和高度平行的分析；

③由于反应时间较短和/或分离时间较短，分析速度更快；

④用于即时护理应用的便携式设备；

⑤低试剂消耗量；

⑥每次分析的全球成本降低。

2.PCR及其在微流体装置中的应用

2.1 PCR需要几种常见混合物的试剂：

①DNA样本：将从中扩增特定序列的原始DNA

②引物：对应于特定扩增DNA序列两端部分序列的一对短核苷酸序列（10-20个碱基对）。他们将因此确定具体的扩增序列。

③核苷酸或更精确的脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）：基本上，将用于合成新的DNA扩增子（即由PCR过程产生的新DNA样品）的4种类型的DNA碱基（A，T，C，G）。

④DNA聚合酶：一种能够通过特异性组装核酸从单链DNA中作为模板创建新DNA链的酶。

一旦混合物准备好，PCR基本上包含在每个PCR阶段的2或3个不同温度之间的温度循环中：

改性：该步骤在94-98℃下进行并导致DNA熔解，即分离DNA链产生两个单独的单链DNA。

退火：该步骤在50-65℃下进行以允许引物退火至与特定扩增的DNA序列的两个末端对应的特定位置处的单链DNA模板。退火阶段可以在与扩展阶段相同的温度下进行，以仅使用2个不同的温度进行PCR。

延伸：此步骤通常在70°C左右进行。温度主要取决于所使用的DNA聚合酶，因为它对应于DNA聚合酶与引物/单链DNA复合物结合以通过掺入周围核苷酸合成新的互补DNA链的阶段。

2.2 PCR微流体装置和应用

PCR主要依赖于温度循环。因此集成设备的关键技术就是它们的加热方法。

在DNA扩增方法中，PCR是首先在微流控芯片上开发的，因为它是最常见和简单的核酸扩增方法。实际上，当芯片上进行PCR以利用微流体优势（速度（3,4），并行化（4）和灵敏度（5））时，其结果分析可以容易地在芯片外执行。

来自Gong等烦人多重集成PCR原型

来自Pal等具有集成电泳分析的微流控PCR芯片，

3. 微流体装置中的加热和温度控制系统

从PCR过程可以看出，温度循环和热化系统是PCR装置的关键技术部分。此外，即使温度只能在实验前校准，最好在PCR过程中监测和控制温度，以获得精确和稳定的样品热量。

为了进一步使PCR微流体装置小型化并加速热处理，可以在其制造期间将金属（大多数为铂）或多晶硅的薄膜直接集成到微流体装置中。

PCR芯片中的薄膜加热器

激光加热PCR液滴膜

4. QPCR及其在微流体装置中的应用

定量PCR（qPCR）也称为实时PCR，但很容易与反转录PCR（RT-PCR，用于RNA分析）混淆。

qPCR依赖于与PCR相同的原理，取而代之的是PCR产物在扩增过程中实时检测，这归功于与适应性光学激发和检测器相关的萤光受体。

嵌入剂qPCR的解析曲线分析

荧光探针机制

与PCR相比，qPCR具有更快的优势（PCR过程中的自动检测），更灵敏，动态范围更广，重复性更好。

QPCR微流体装置和应用

与PCR一样，微流体装置能够加速热化过程以实现快速qPCR过程（20分钟内40个qPCR循环，商业标准系统约1小时），有助于缩小PCR工作体积，同时保持相同的扩增效率和灵敏度（即最小核酸浓度可检测）比常规商业系统。

微流体装置也被开发用于平行病原体检测（水寄生虫）使用毛细管注射和预装引物，大大简化了系统的复杂性和最终用户的任务。

微流体qPCR装置

5. RT-PCR＆QRT-PCR及其在微流体装置中的应用

PCR可用于DNA检测，但它也可用于通过简单地向PCR过程添加先前步骤来检测RNA。事实上，RNA结构非常接近DNA，但含有核糖而不是脱氧核糖和尿嘧啶碱基而不是胸腺嘧啶。而且，在其大部分生物学作用中，RNA是单链分子，比DNA序列短得多。通过RT-PCR进行RNA定量的主要应用是来自信使RNA（mRNA）和病毒检测（许多病毒是RNA病毒）的基因表达分析。

在70年代，发现了逆转录酶，即能够使DNA在RNA中逆转录的酶。因此，通过使用包含逆转录聚合酶和大约50℃的先前热化步骤的PCR生物化学试剂，可以从RNA中获得互补DNA（cDNA），然后可以像常规PCR过程那样扩增cDNA。

DNA和RNA之间的差异

以与PCR和qPCR相同的方式，可以在qRT-PCR过程的扩增期间实时检测RT-PCR产物。区分RT-PCR和qPCR很重要。RT-PCR以前可用于逆转录聚合酶链式反应和实时聚合酶链式反应。所以使用RT-PCR很容易让人对上述过程感到困惑。所以现在使用定量聚合酶链式反应及其缩写qPCR代替实时聚合酶链式反应。定量逆转录聚合酶链式反应是如此简化的qRT-PCR。

RT-PCR：不同的RT引物类型

RT-PCR：一步和两步法

RT-PCR和QRT-PCR微流体装置和应用

两步qRT-PCR也可用于进行病毒离片RT步骤，然后用微流控芯片进行PCR以加速处理持续时间（15分钟（31）30个循环，17分钟40个循环（ 35）），同时保持商业系统的效率和灵敏度（31）或降低它们（35）。

一步式qRT-PCR也已经用与热和光学系统有关的聚合物微流控芯片制成，但与商业系统相比产生降低的效率（36）。其他集成系统通过将反应时间缩短至35分钟达50个循环（37），在芯片上进行一步式双相样品qRT-PCR（37），将循环阈值与商业系统进行比较，但不考虑效率和灵敏度。

最初，RT-PCR产物也可以通过比色法在微流控芯片内进行检测，使用免疫层析试纸条，如妊娠试验中使用的那些（38）。这种类型的系统大大简化了检测设置，因为它不需要任何光学分析。

与免疫色谱（或侧向流动）检测相关的微流控RT-PCR测定

6. MICROFLUIDIC CONTINUOUS FLOW/FLOW-THROUGH AND OSCILLATING FLOW PCR

Microfluidic Continuous Flow/Flow-through system for 30 PCR cycles with the different heating zones pointed out

Microfluidic Oscillating flow PCR chip. The 1st RTV layer correspond to the PDMS Quake valve and the second one to the PDMS microfluidic channels for PCR sample.

7.微流控数字PCR

随着微流体技术的发展，出现了处理微流体装置内的乳液和液滴的数字微流体。现在，数字PCR（dPCR）已通过多家公司商业化，专门用于超灵敏检测。尽管如此，dPCR需要更长的加热时间以在所有产生的液滴在PCR管中转移后获得均匀的热化。

初期数字微流体装置

数字PCR用于罕见突变检测

8.微流体单细胞PCR和RT-PCR

单细胞PCR / RT-PCR的优势在于可以精确定量和区分每个单细胞的基因表达，即使它们代表了全球细胞群体中相对非常小的一个群体，而不会在获得的平均基因表达中丢失通过评估细胞类型的所有细胞。因此可以检测到非常罕见的生物事件。

单细胞RT PCR分析，来自White等，PNAS，2011

用于单细胞分析的微流体液滴qRT-PCR装置来自Eastburn等，Analytical Chemistry，2013

微流体已广泛用于不同的DNA扩增过程（PCR，qPCR，RT-PCR）。微流体装置能够加速PCR过程，减少试剂消耗，达到高通量分析并将PCR前后分析整合在一起。