小芯片 大用途 微流控芯片细胞分析

中国有句谚语，“工欲善其事，必先利其器”，为了阐明细胞的生命过程，需要特殊的工具。

细胞作为生命组成的最小单元，研究其相关的生物行为及其规律与本质，对于揭示生命的奥秘，探索疾病的机理与治疗手段，提高人类的生存寿命与质量，都有着重要的意义。

对细胞的研究是一个复杂的工程，细胞在人体内处于复杂的微环境之中，包括温度、氧气浓度、生物因子浓度、机械作用、细胞间相互作用、细胞基质间相互作用等，同时，细胞体积微小、种类多样，在细胞水平进行细胞识别、代谢物检测、内部组分分析、细胞结构与功能表征、细胞间相互作用分析等工作也都有着很大的难度。

微流控（microfluidics）指的是使用微通道（尺寸为数十到数百微米）处理或操纵微小流体的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。

因为具有微型化、集成化等特征，微流控装置通常被称为微流控芯片（microfluidic chip），又称微全分析系统（micro total analysis system，μTAS）或者芯片实验室（lab on a chip，LOC），于20世纪90 年代初开始引起人们的关注。微流控技术因具有一系列优点，如样品试剂消耗少、结构功能多样化、集成化程度高、与细胞尺度接近等，近年来被广泛地应用于细胞相关领域的研究，包括细胞培养、细胞捕获、细胞分化、细胞迁移、细胞融合、药物代谢、细胞通信、组织工程等，通过结合不同的分析检测方法以及集成不同的功能操作单元，取得了巨大的研究进展，解决了很多传统方法无法解决的问题。但是，如何在微流控芯片内更加高效简便地对细胞进行操控定位，如何更好地模拟细胞在生命体内的生物微环境，从而进行体外生物系统的构建，用于生命医疗疾病的研究，仍然需要在相关技术、材料、方法等方面做出更深入的研究。

《微流控芯片细胞分析》的英文版本由国际知名出版商Springer于2017年出版，问世后两个月下载3000次，位列该年度top10。

该书从第1 章“微流控芯片的设计和制作”，至最后的第13 章“基于微流控技术的微生物学研究”，许多内容来自作者实验室的研究成果或者科研经验总结，深入浅出，简单易懂。书中章节既有独立性又有相关的参考性，以正在从事微流控芯片或者细胞分析研究的科研工作者以及开展博士论文或者硕士论文研究的研究生为读者对象，尽最大可能地收集与每一章节有关的参考文献。作者希望本书能够帮助渴望了解更多有关微流控芯片和细胞分析相关知识的研究者和学生，并与所研制的细胞分析微流控芯片-质谱联用仪器进行配套，推动微流控技术的快速发展。

单细胞分析与微流控技术

大多数真核细胞都是单一的个体，但是在进化过程中，它们已经可以互相关联并密切相互作用形成组织、器官，甚至整个植物或者动物。然而，单细胞分析通常只关注组织或者器官中的单个细胞。即使在相同的培养条件下，同源细胞在单细胞层面上也会具有形态、基因表达水平以及生长特性上的差别。

此外，单细胞分析对于细胞内生命过程的机理解释具有重要的作用。当我们研究单个细胞，试图理解它们如何在生物系统中发挥作用时，可以了解生命系统的发展，生命的成长和特殊化，以及单个细胞和整个生物体的进化。如果我们能在分子水平上理解生命现象，也许可以理解在细胞上的细微差别诱导生物现象如学习和记忆，或者了解细胞的微小改变导致疾病或者生命功能障碍，如癌症。

为了开发新型的针对细胞层面的治疗干预措施，对于生物异质性及物质传输通道的理解就变得尤其重要，这些研究会应用到罕见但重要的细胞类型，如干细胞或祖细胞。由此，开发出了广泛而多样的单细胞分析研究方法，以分析它们的形态和生理特征，同时获得分子、基因、转录和定量生物化学信息，甚至在模拟生物体内条件的状态下监视细胞的动态变化。同时，在功能齐全的生物体内，单个细胞可以被标记和追踪，最终实现在细胞原本无干扰的自然环境中得到分析研究。

目前，单细胞分析面临的挑战是单个细胞的尺寸很小，因此分析技术必须能够用于微量的样本分析。然而，为了获得足够的有效的数据统计，实验应该实现高通量，同时实验成本还应该降低，以让更多实验室能够在经济上负担得起。在过去的几年里，巨大的技术发展可以实现在所有领域的单细胞分析。单细胞分析是对细胞内转录、翻译、调控等内部信号在单个细胞条件下分子水平的测量，其目标是从单个细胞层面上分析以全面地理解细胞种群。这个方法让研究人员从分子的角度揭开单细胞与组织、器官甚至生命体的行为之间的联系。单细胞分析技术在过去的十多年里获得重要的发展，大量相关的科研工作得以发表。

单细胞分析研究领域正迅速地发展，许多研究从之前的大量细胞分析转变为单细胞分析，这得益于对单细胞的异质性和随机性的研究。这些细胞种群的随机变化可能是受种群内在的影响。不同细胞个体在转录、翻译等活动中存在差异，使得细胞内的离子、mRNA 和蛋白等物质表现出细胞间的异质性。

由于细胞膜的灵活性和动态特性，反应和分子碰撞会随机发生。因此，在一个细胞种群中所有细胞在任何时刻都会存在一定的差异，只有大量的单细胞分析测试才能揭示它们的异质性并提供统计数据，同时建立模型。在微流控技术发展的过程中，样品前处理分析规模被微型化，使得样品处理更加简单方便。如今，微流控系统已经可以应用于广泛的单细胞研究中。鉴于微流控技术的作用在单细胞分析中越来越明显，可以预计不断持续发展的微流控技术会更好地促进单细胞分析的发展。

基于微流控芯片的生物组织解离方法

传统的组织培养需要在固定的时间点更换培养基，这样可以持续为细胞提供营养，从而维持营养物质和排泄物浓度在整个细胞的生命周期中保持稳定。为了更好地创建一个模拟体内组织流动的环境，Hattersley 等设计了一种微流控装置，在芯片上灌注培养、分析、解离完整的鼠的肝组织，如图1（a）所示。

实验过程简述如下：使用乙二醇四乙酸（EGTA）灌注固定的组织以清除Ca²⁺，然后灌注伯爵平衡盐溶液（EBS）以清除EGTA，防止胶原酶被抑制。接下来，灌注胶原酶消化组织。最后，以高流速（500 μL/min）快速灌注冰冷的分散缓冲剂。被冲下来的分散的细胞可以直接在芯片的输出口收集到离心管中。这种利用微流控芯片的组织解离方法可以减少组织或细胞暴露在未消毒的环境下的时间，从而减少污染的风险。然而由于解离时间较长，此方法并不适合在基因表达分析中使用。为了严格实现从生物组织中分离单细胞，Lin 等设计了一个微流控细胞解离芯片（μCDC）。这个芯片由50 μm 宽、167 μm 高、间距20 μm 的多个微柱组成，如图1（b）和（c）所示。在这个工作中，将含有小鼠大脑肿瘤细胞DC115 和KT88 的神经球组织用注射泵以3～15 mL/min的速率通过设计的微柱阵列后，最终解离成单个细胞。通过μCDC 芯片处理得到单细胞的产率在81%～85%之间，其中具有活性的单细胞产率在80%～85%之间。这个方法在解离生物组织时相比传统的研磨法具有高产率的优势，细胞经过芯片解离后，存活率会更高。然而由于机械分离的固有缺陷，分离的速率较慢。

图1 （a）可以进行组织整体培养和解离的芯片[21]；（b）通过软光刻技术及PDMS 制备的单通道μCDC 芯片；（c）生物组织通过微柱机械地分离为单个细胞的SEM 照片；（d）经由芯片进行组织解离的芯片示意图

基于微流控技术的细胞分选方法

微流控细胞分选技术的出现突破了荧光激活细胞分选法和磁激活细胞分选法的一些限制。相比于传统的细胞分选方法，微流控装置本质上更有利于细胞分选。微流控设备微型化的特点，使得在实验操作中试剂消耗量降低，同时提高了便携性；制造微流控芯片可以使用标准的制造体系和软光刻技术，大大降低了生产成本；在微流控芯片中简化了实验的操作步骤，同时还减少了细胞样品污染的风险。

然而，微流控细胞分选需要进一步发展才能取代传统的细胞分选技术。微流控系统相比商业流式细胞仪的主要缺点是分选通量和效率低。因此，提高其实验效率是当前的一个研究重点。另外，通过软光刻技术制造的微流控装置在实验中容易导致细胞黏附和堵塞，影响了它的使用寿命。

单细胞提取

微流控装置在单细胞提取中具有许多优势。由于核糖核酸等生物分子在细胞中的含量可低至0.01～2.5 pg/单个细胞，这要求尽可能少地对提取出的单细胞进行稀释。在微流控芯片中，每个单细胞通过芯片内的固定结构被分隔在不同的区域，每个区域通过微型化以减少裂解产物稀释，这对于分析低含量的生物分子十分关键。微流控系统所消耗的试剂体积小，从而降低了实验成本。提取出的单细胞可以通过显微镜可视化操作紧密排列。此外，大多数微流控系统完全是自动、封闭系统，减少了样品污染的风险。

单细胞裂解

微流控系统为单细胞裂解提供了一个理想的平台，由于芯片可以制造成特定的几何形状并且可以具有精确的尺寸大小，可以避免单细胞裂解中其他细胞的干扰。微流控芯片的长度与单个细胞相匹配从而使得稀释程度最小化以增加检测灵敏度。大部分芯片是光学透明的，允许可视化操作。微流控单细胞裂解方法有很多种，每种方法都有各自的优点，这将在接下来的部分讨论。根据不同的实验影响因素，选择合适的技术对于裂解的结果是至关重要的。

图2 微流控芯片中利用机械力裂解单细胞的原理图

单细胞分析检测

单细胞分析的最后一个步骤是单细胞分析检测。将细胞通过之前一系列步骤—组织解离、细胞分选、单细胞分离、单细胞裂解提取出所需要分析的物质后，最后一步就是通过特定的方法对这些分子进行检测和表征，进而得到所需要的细胞信息等。目前常用的单细胞分析手段主要包括荧光成像、电化学分析及质谱分析三种方法。

1.单细胞荧光成像

在很长一段时间内，荧光成像是使用最普遍的单细胞分析方法，它在单细胞分析研究中有着至关重要的作用。单细胞荧光成像在细胞内化学成分的检测方面有着独特的优势。它能够提供具有高对比度的化学物质专一性图像，并且能够进行实时的活体成像。尽管荧光成像具有上述优势，但是它要求目标分子能够产生荧光。对于本身没有荧光的分子，需要通过化学标记或基因标记的手段使其带上能够发光的荧光官能团，这在一定程度上限制了荧光成像的应用。发展新的荧光标记方法一直是荧光成像的研究热点。另外，标记对代谢物分子本身的性质有一定的影响，尤其是小分子代谢物。由于光谱重叠的问题，单细胞荧光成像也很难对多种代谢物进行同时成像。

2.单细胞电化学分析 

电化学方法能够对单细胞中的代谢物进行实时定量检测。以电化学方法在神经科学上的研究为例，Adams在20 世纪70 年代对神经递质方面的研究开创了这方面的先河。目前，电化学方法在单细胞分析上的应用已经不再局限于神经递质的研究，而是拓展到了细胞内的各种小分子或者大分子的研究。然而与荧光成像方法类似，电化学方法也难以实现多组分的同时检测。

3.单细胞质谱分析

质谱是一种很适合于单细胞分析的检测方法。它具有极高的灵敏度，能够对多种物质同时进行检测，而且具有对所感兴趣的分子进行结构鉴定的能力。目前，人们已经发展出了多种离子化方法，这些方法能够对不同类型的样品进行解吸附/离子化，主要包括电喷雾/纳米电喷雾离子化（ESI/nano-ESI）、激光剥蚀/激光解吸附离子化（LA/LDI）及二次离子化质谱（SIMS）等。这些离子化方法能用于对不同种类的物质进行离子化，如蛋白质、多肽、酯类、小分子代谢物及元素等。由于单细胞质谱分析无需标记，且能够进行多组分的同时分析，因而在近年来的单细胞研究中逐渐受到关注。

单细胞分析是一个新兴且迅速扩张的研究领域，在这个领域中不断有新技术的出现，这使得人们很难预测领域内未来的关注点和应用。然而，不可否认的是，创新的微流控技术已经在单细胞分析领域中做出了巨大的贡献并将持续发挥重要的作用。在未来，很可能会出现更多用于组织分离的微流控装置。然而，用于组织分离的微流控技术依然不如用于细胞分选的技术成熟，这是因为传统的组织分离方法是最廉价和有效的。相比之下，细胞分选仍然由经济因素驱使，往往是需要隔离的稀有细胞群通过细胞分选的过程来富集。那么这个步骤就需要一个简单、低成本、高通量的细胞分选系统，而这正是微流控装置的优势所在。因此，我们预计微流控细胞分选领域的研究工作将会继续增多。

现代的单细胞分析技术尤其令人兴奋。在扩增、测序和微流控方面的技术进步使得我们可以通过前所未有的方式探测生命的基本单位—细胞。单细胞分析会在癌症、免疫学、进化生物学、干细胞等研究中产生持久的影响。目前，研究人员通过将细胞从其生长的微环境转移到分析缓冲区中研究单细胞。因此，细胞的原生环境的影响完全被剥离出来，而且细胞分析的过程也是不可逆转的变化。人们普遍认为细胞的生长环境对于细胞内的分子信号具有重大的影响，这也促进了微流控芯片在模拟生物内环境的同时进行单细胞分析工作的发展。

微流控装置相比传统的单细胞分析装置在实现单细胞多参数测量时有更大的潜力且有更快的测试速度。然而，微流控装置的灵敏度和特异性仍然需要改进。在未来，微流控技术的发展将会带来更多的应用，使得单细胞分析领域继续向前推进。

本文摘编自林金明著《微流控芯片细胞分析》之文前及第八章，内容有删减。