林金明, David A. Weitz：核壳支架中异型细胞的受控组装：液滴中的器官
作者：余韩洁钰&周子琦
几乎所有组织都是由多种类型的细胞和细胞外基质（ECM）集成的3D结构。组织功能的实现，需要细胞间信号传导，以及细胞与周围ECM相互作用。肝脏是由排列在3D支架原代肝细胞、肝星状细胞、库普弗细胞、内皮细胞、成纤维细胞等组成的。
目前研究者们也用很多不同的方式构建了3D肝模型，包括小型的多孔培养系统、3D细胞打印、3D细胞成型等。它大都是将肝细胞与其他细胞在微模式的3D支架中培养，当异型细胞之间足够近时，会产生生化相互作用，它们之间相互协调，从而实现改善的肝特异性功能。但这些技术可能在均匀性、可移植性和数量方面受到一定限制。所以本文想要做能够精确控制的3D结构中的不同细胞组成的多功能人类微组织。
本文报道了通过在生物相容性的3D核-壳凝胶支架中控制异型细胞的组装，如下图所示，基于微流控技术来产生高度单分散的结构，在液滴中创建人造肝脏。研究者制造水-水-油（w / w / o）双重乳液，并将其用作模板，成功地将3D核-壳支架与肝细胞整合到壳中的成纤维细胞包围的核心中。
图1 原理图
如图2b和2c所示，微流控芯片的内相是细胞培养基，中相是藻酸盐水溶液，其中有Ca-EDTA复合物，由于雷诺数低，内相与中相共流，在交汇处由于氟化碳油，形成单分散的由水性核心和水凝胶壳组成的液滴。下游引入了一种额外的油流，该油流包含0.15％的乙酸，并触发藻酸盐溶液中Ca 2+从Ca-EDTA复合物中释放出来；随后，二价Ca 2+与藻酸盐链的两个不同羧基结合，形成交联的3D网络，如图2a。文中还通过用荧光素标记藻酸盐，进行荧光共聚焦显微镜观察，得出单分散核-壳液滴的直径为169±6μm。
图2 a) 通过触发Ca2+从Ca-EDTA复合物中释放而使藻酸盐网络交联。b)PDMS设备的示意图。c) 使用w / w / o双乳液作为模板制备核-壳液滴。d) 使用基于液滴的微流体产生的单分散核-壳液滴。
为了将肝细胞组装在核心中，将肝细胞预混在內相的培养基中，其被凝胶壳包裹在核心中，经过几天的培养开始出现聚集体，如图3a所示。同样的，当把成纤维细胞预混在海藻酸盐溶液的中间相时，其就被海藻酸盐网络限制在壳中，并且在核中没有观察到细胞，如图3b所示。为了模拟人类肝脏3D结构，将肝癌细胞HepG2组装在被成纤维细胞NIH-3T3包围的核心中。该研究中，通过壳中藻酸盐的原位交联形成球体，并将球体快速转移到细胞培养基中，把细胞暴露于弱酸性条件是有限的，并且对细胞活力几乎没有影响。如图3c多为活细胞（绿色），几乎没有死细胞（红色）。
图3 3D核-壳支架中不同细胞的空间组装a) 凝胶壳将HepG2细胞限制在核心中。b)通过交联的藻酸盐网络固定在壳中的NIH-3T3成纤维细胞。c) 肝细胞在核心中同时组装，在壳中成纤维细胞同时组装，形成一滴人造肝脏。（比例尺100μm，细胞活力通过钙黄绿素AM /EthD-1染色试剂盒进行表征。）
如图4，在37°C的培养基中培养核-壳球体，两周后仍保持其球形，在此期间细胞变得更致密。将其冻干，在扫描电子显微镜下页观察到了明显的球形。此外，冷冻干燥的球体的横截面显示出核心中的密集细胞聚集体和壳中的分散细胞。海藻酸盐水凝胶的外壳坚固耐用，同时具有很高的渗透性，使营养物质和代谢产物能够通过。交联海藻酸盐的水凝胶壳在机械上是坚固的，将其存储于-80°C下，依然能在37°C不破坏结构或影响细胞活力的情况下再次培养。经过10天的培养，细胞也基本都是活的，没有死细胞出现（红色）。14天后，细胞活力略有下降，作者解释说，可能因为细胞增殖产生了高细胞密度，核心处有低氧状况出现。
图4 在核-壳球体中共培养肝细胞和成纤维细胞。a-c) 肝细胞在核心和壳中的成纤维细胞分别共培养1天，7天和14天。随着时间的推移，保持其球形形态。d-e)SEM图像。f) 在核-壳结构中空间受限的细胞集合。g）在-80℃下冻两周然后在37℃下融化之后，封装在球状体中的细胞的高存活力。h）封装在球体中的细胞共培养10天显示出高细胞活力。i）培养14天的细胞的活力略有下降。
为了在一滴中测量微组织的肝脏特异性功能，随时间监测其白蛋白分泌和尿素合成。白蛋白和尿素是肝脏的关键生物标志物。用相同数量的肝细胞培养了两个样品，一个在核-壳结构中，壳中有成纤维细胞，另一个没有成纤维细胞，并分别使用白蛋白和尿素检测试剂盒监测培养基中白蛋白和尿素的浓度。相比肝细胞的单型培养单独，肝细胞和成纤维细胞的共培养的核壳球状体的白分泌和尿素合成都增加了，表明3D微型共培养与传统的单型细胞培养相比，有了显著增强的肝脏特异性功能。
图5 肝细胞/成纤维细胞共培养和肝细胞培养的肝脏特异性功能的测定。在七天内测量的HepG2 / NIH-3T3共培养和HepG2培养的a)白蛋白分泌和b）尿素合成。
总之，本文使用基于液滴的微流控技术，将肝细胞和成纤维细胞分层组装成3D核-壳支架，在每个液滴中形成人造肝脏。并表明嵌入3D核-壳支架中的肝细胞和成纤维细胞的共培养是体外肝脏的良好模型。具有同型和异型细胞间相互作用的平衡，有利于其表达肝脏的特定功能。
此外，来自西北大学合成与天然功能分子化学重点实验室的范海明教授团队利用类似上文的方式，使用实验室触手可得的枪头完成了3D肝细胞培养，找到了枪头培养的最适细胞液体积以及癌相关成纤维细胞与肝癌细胞的最适比例，并在此基础上探究了线粒体靶向磁热疗的治疗能力。研究中使用了TPP（线粒体受体靶向分子）修饰在磁珠表面实现对线粒体的靶向作用。
图6 肝肿瘤椭球体重建检测线粒体靶向磁疗治疗效果
实验原理如图7所示，研究者将规格为200μL的枪头一分为二，留下宽大的一部分，将边缘打磨光滑，将其中注入一定量的成纤维细胞与肝癌细胞混合液进行培养。在这部分中，研究者对混合培养液的体积进行了优化，发现当细胞液滴与枪头切割面夹角a为30°时，细胞液体悬浮状态最稳定，能在枪头尖端保持较长时间，此时的体积为50μL。
图7 实验原理图。a图显示了使用枪头培养的具体操作；b图显示了不同体积的细胞混合液在枪头末端与枪头截面形成的夹角a大小（a代表80μL，a’代表50μL）；c图显示了夹角与细胞混合液体积的关系。
在本研究中使用的3T3成纤维细胞携带H2BGFP标记物，这使得它们很容易与非荧光HepG2细胞区分开来。在亮场和荧光成像中均可观察到3T3成纤维细胞，而HepG2只能在亮场下观察到。利用这一区别，研究则发现悬浮液滴中形成的球体具有层状结构，其中3T3成纤维细胞形成ECM外壳(绿色荧光)，核心为HepG2(黑色)。结果模型如下图8B所示。
图8 液滴中3T3成纤维细胞和HepG2细胞形成的肝球体的结构特征。a图显示在液滴中培养3天后，显示肝脏球体三维构象的亮场图像；b图为模型示意图；c图展示了不同层位(z轴位置)肝球体的荧光图像显示，三维肝球体的外层主要由3T3成纤维细胞构成，荧光标记物为H2BGFP；d,e图显示了在孔板培养7天后，球体逐渐降解。在图2D中，右侧面板的图像是区域1和区域2的放大图，显示了3T3成纤维细胞和HepG2细胞的区域分布。图E中的白色箭头用H2B-GFP荧光标记物鉴定3T3成纤维细胞。
研究者同样对肝癌细胞进行了染色。他们使用CMAC染色肝癌细胞。与之前GFP标记成纤维细胞的分布重叠发现，结论仍与前一致，即肝癌细胞在中央，成纤维细胞在周围。
图9 TPP-磁珠对肝癌细胞生存的影响。a图显示了铁浓度与细胞存活率的关系，结果表明细胞存活率与铁含量无关；b图显示了在没有明显的细胞毒性的情况下，添加和不添加TPP涂层的SPIONs的细胞摄取磁珠的数量都在孵育4小时后显著增加，并在12小时后趋于饱和，?17pg /cell。长时间孵育至24小时，未见进一步增加，说明TPP涂层对细胞膜转运SPIONs没有影响；c图显示了对于磁热疗, TPP- spions可以诱导大约76%的HepG2细胞死亡，而在没有TPP涂层的情况下，可以诱导约26%的HepG2细胞死亡。说明TPP可以很好的靶向线粒体，进而通过线粒体的损伤杀死癌细胞；d,e两图是用透射电镜(TEM)观察有无TPP包覆的SPIONs在细胞膜内的内化和分布。培养12 h后，无TPP包覆的SPIONs主要出现在核内体或溶酶体中。然而，TPP-SPIONs进入线粒体，并保持球形。说明TPP可以很好的靶向线粒体。
通过消化肝肿瘤球体和测定铁的含量来评估tpp - spions的摄取。结果与假设一致，即TPP-SPIONs的入侵受到球壳结构的抑制，Fe的摄取量在单层HepG2细胞中最高(?17pg /cell)，以球壳的形式最低(图C)。球粒-100(低3T3比，1:10)与单层培养细胞(3T3比，1:10)相似，说明两种情况下NPs均可与大多数细胞接触。相比之下，位于球体中心(3T3比1:10)的细胞被“外壳”阻止与NPs接触，这是铁吸收量显著下降的原因(图C中的黄色条形图)。长时间的培养皿培养至24小时不会影响细胞的整体生存能力。假设每个细胞接受相同数量的NPs，那么在球体培养中与NPs接触的细胞数量约为单层培养细胞的40%。10分钟后肝肿瘤球形内细胞的整体活力与铁的摄取量呈负相关(图D)。在磁热疗过程中，TPP-SPIONs的效率是通过将细胞活力值正常化为铁的摄入量来评估的(图E)。结果发现，当HepG2细胞维持单层时，TPP-SPION诱导的细胞凋亡最显著，而当处理肝肿瘤球形时，TPP-SPION诱导的细胞凋亡效果最差。
图10 用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)法测定3T3成纤维细胞和HepG2细胞的存活率，并分析其与肝椭球体组成的关系（图片解释见上文）
总的来说，范海明教授团队运用前人3D细胞培养的理念，独创了基于枪头的3D球体细胞培养技术，并探究了TPP连接对于磁热疗的影响，结果发现，由成纤维细胞与肝癌细胞共同组成的细胞球体会阻碍磁热疗的进行，作者推测是球壳结构中形成的细胞外基质（ECM）微环境阻碍了肝癌细胞对磁珠的摄入，具体原因有待后续探究。
点评：1.可以将肝细胞和成纤维细胞替代为其他细胞，以构建其他组织模型并研究一般的细胞间相互作用。 2.作为高通量药物筛选的体外肝模型，具备一定前景。3.文章2探究了SPIONs与TPP-SPIONs目前存在的问题。
声明：1. 本文版权归原作者所有，公众号和媒体转载请与我们联系！2. 因学识有限，难免有所疏漏和谬误，恳请批评指正！3. 本文主要参考以下文献，仅用于对相关科学研究的介绍、评论或课堂教学，不得作为商业用途。如有任何版权问题，请随时与我们联系！1.Chen Q, Utech S, Chen D, et al. Controlledassembly of heterotypic cells in a core–shell scaffold: organ in a droplet[J].Lab on a Chip, 2016, 16(8): 1346-1349.2. Peng X , Wang B ,Yang Y , et al. Liver Tumor Spheroid Reconstitution for Testing MitochondrialTargeted Magnetic Hyperthermia Treatment[J]. ACS Biomaterials Science &Engineering, 2019.
转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除。