液体活检进化史

组织活检是目前癌症诊断的金标准，但是具有创伤性且多次活检患者依从性差，而液体活检无创且可以实时监测成为了检验科新的趋势。那么什么是液体活检？其是指循环肿瘤细胞，循环肿瘤DNA和外泌体。通过非侵入性的取样方法获得肿瘤细胞信息，辅助肿瘤治疗的突破性检测技术。而本文重点介绍当前热门的CTCs和ctDNA检测技术的进展。 

1. CTCs检测技术的进展

1869年，Ashworth首次提出循环肿瘤细胞（CTCs）——原发灶或转移灶脱落进入外周血的肿瘤细胞，其包含有原发性肿瘤的遗传信息和表型。

       CTCs在血液中的含量极少，因此对其进行研究时必须先进行富集。富集方法主要包括梯度离心法、过滤法和免疫磁性分选法。检测方法包括免疫学技术、反转录聚合酶连锁反应技术、酶联免疫斑点技术以及CTC 芯片技术。

图1. CellSearch 检测CTCs代表性例子的结果示意图

其中免疫磁性分选法是当前最常用的一种CTC富集方法。而强生公司研发的专有技术CellSearch检测系统（图1）已经成为CTC检测的一个标准实验方案，特异度达到80%。通过上皮细胞黏附因子标记的抗体磁珠来捕获CTC，然后细胞内角质蛋白荧光抗体(CKPE)可以识别上皮细胞，白细胞荧光抗体(CD45-APC)能够识别白细胞以及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，荧光核染料用于生成显微镜下可视细胞图像。其中符合肿瘤细胞学形态特征而同时CKPE (+)、DAPI (+) 和CD45(－)的细胞被定义为CTC。该方法只需要7.5ml血液样本，即可从几百亿血液细胞中检测到一个CTC。 CellSearch 检测系统目前也已经被FDA批准进入临床应用。

2.ctDNA检测技术的进展

1940年Mandel和Metais首次提出了细胞外游离核酸（ctDNA），其主要来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞的DNA片段，随着人体血液循环系统不断的流动，并携带有基因突变、缺失、重排、拷贝数异常和甲基化等信息。但是ctDNA在肿瘤患者体内的含量很低，约占整体cfDNA 的1%，半衰期短，约为２ｈ。因此需要灵敏度高的检测技术。

       ctDNA 检测技术可分为两个阶段。第一阶段为基于PCR 技术的检测技术，如突变扩增阻滞系统(ARMS) 法、直接测序法( Sanger法)、微滴数字化PCR(dPCR) 等。第二阶段为在NGS 基础上发展起来的检测方法。

图2. ARMS法

ARMS法(图2)的原理是PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能进行扩增，需要设计等位基因特异性PCR扩增引物，只有在引物3'碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出目的基因是否突变。以提取到的ctDNA作为模板可用于检测是否发生特定的基因突变。例如，用人类EGFR基因突变检测试剂盒检测EGFR基因是否发生突变。当EGFR基因为野生型时，一般情况下无法延伸，只有当EGFR基因发生突变时引物可与模板完全匹配，随即发生相应的扩增。若EGFR基因未发生突变则无扩增。

数字PCR (dPCR)(图3)是将一个标准的PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子( ctDNA作为模板)，实现单个反应器单条模板的PCR扩增，扩增结束后，通过阳性反应器的数目计算目标序列的拷贝数，是一种DNA定量的新技术。优点是可以对ctDNA进行绝对定量，灵敏度可达到单个核酸分子，检测限低至0.001%，但缺点是只能检测已知的突变位点且通量低。

二代测序法是利用测序仪器来捕捉新渗入的末端荧光标记来确定DNA序列的组成，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。同样可以将提取到的ctDNA用其进行检测。不仅可以检测已知基因变异，更重要的是可以进行全基因组范围内的基因变异分析，包括基因突变、重排以及基因组拷贝数变异(CNV)，并可以发现未知的基因变异。