液体活检（Liquid Biopsy）CTC-iChip系统 肝癌实时监控的灵敏手段

原创： 肝胆蒋贝格Dr.李

作为全球致死率第二高的癌症——肝癌，每年大概有76.5万人因肝癌死亡。临床实践证明，肝癌成功切除后的预后，取决于早诊断。只要在极早期/早期被诊断出来肝癌，并加以有针对性的治疗，肝癌的治愈率将会大大地提高。目前的肝癌筛查的方法有：血液AFP的检测、腹部超声、CT、MRI等检查。虽然，上述方法能够发现部分小的肝脏肿瘤，但是敏感性、特异性都较低，而且肝癌的良、恶性病变相对较难判断。

微流控CTC-iChip系统

肝癌在癌变早期会有少量的肝癌细胞会随着血液循环进入血管中，但是由于细胞量很少，或者由于血液中有大量的红细胞、白细胞等及其他脏器来源的细胞的干扰往往不能够灵敏地、特异地检测到肝癌细胞。最近，来自美国哈佛医学院的Haber教授带领的研究团队发明了一种技术，能够通过检测血液中极微量的肝癌细胞来筛查肝癌的发生。该技术命名为微流控CTC-iChip系统（microfluidicCTC-iChip）。微流控CTC-iChip系统的工作原理：将抽提的血液放入CTC-iChip微流控装置中，在CTC-iChip微流控装置中首先根据细胞大小将血液中的红细胞、血小板和血浆分离出去，然后利用结合有白细胞CD45、CD16和CD66B抗体的磁珠将白细胞分离出去，经过CTC-iChip微流控装置后血液循环中的癌细胞（circulatingtumorcells，CTCs）被富集；然后再通过检测肝癌细胞特异的转录子来判断这些癌细胞是否来自肝脏（图1）。

图1.微流控CTC-iChip系统筛查血液中的肝癌的工作原理。CTC:circulatingtumorcell,血液循环中的肿瘤细胞；WBC：whitebloodcell，白细胞。

微流控CTC-iChip系统的优势

特异性和灵敏性是肝癌筛选最关系的两大问题，那么，微流控CTC-iChip系统是如何做到特异性和灵敏性的呢？

1.特异性

10个肝癌特异标记分子确保特异性：每个细胞都有自己特异的分子来行使自己的功能，毫无疑问肝癌也存在自己特异的分子-即肝癌特异分子标记物。对现已公开的微阵列数据库中的2万个基因进行分析，挑选出在血液细胞、肝脏以外的脏器都不表达但是在大部分肝癌中高表达的100个基因。然后，利用CTC-iChip系统检测分别检测10个患有肝癌的病人和8个健康的志愿者的血液中上述得到的100个基因。通过比较分析，最终确定10个基因作为特异性检测循环中的肝癌细胞（图2）。

（注：10个基因为甲胎蛋白（Alphafetoprotein，AFP），a2-羟色胺糖蛋白（alpha2-HSglycoprotein，AHSG），白蛋白（albumin，ALB），载脂蛋白H（apolipoproteinH，APOH），脂肪酸结合蛋白1（fattyacidbindingprotein1，FABP1），纤维蛋白原b链（fibrinogenbetachain，FGB），纤维蛋白g链（fibrinogengammachain，FGG），磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican3，GPC3），视黄醇结合蛋白4（retinolbindingprotein4，RBP4），和转铁蛋白（transferrin，TF）。

图2.微流控CTC-iChip系统能够特异地识别肝癌细胞。

2.灵敏性

完整全转录组扩增和微滴式数字PCR系统提高检测的灵敏性和特异性：将分选得到的CTC细胞作完整全转录组扩增（whole-transcriptomeamplification，WTA），经完整全转录组扩增的cDNA分子被包裹在单个液滴中再通过液滴PCR扩增进行定量分析判断。为了证明上述技术的灵敏性，将1、3、5、10或50个HepG2细胞混入4毫升健康供体的血液，然后通过CTC-iChip系统检测。发现该技术能够检测到一个肝癌细胞，当然肝脏特异基因信号会随着细胞数量的增加而增加（图3）。

图3.饼图显示经过完整全转录组扩增后可以提高检测的灵敏性。

可见，该肝癌筛选系统有如下几大优势：

1）无创检测，检测时只需要提取血液即可

2）特异性高

3）灵敏高，在肝癌的极早期就能够检测到

与传统的肝癌筛查指标（AFP）的比较：1、通过检测两名肝癌患者（编号分别为HCC-041和HCC-075），间隔1周抽取他们血液分别作CTC-iChip和血液AFP检测，发现CTC评分（CTC-iChip检测获得的指标）在两个患者都很高，而血液AFP在HCC-075患者体内没有检测到，说明CTC-iChip系统的特异性更高（图4A）。2、两个肝癌患者（编号分别为HCC-058和HCC-060）接受外科肿瘤切除术，利用CTC-iChip和血液AFP检测进行术后，结果显示CTC评分更加灵敏（图4B）。3、在接受免疫检查点抑制剂（NIVolumab）治疗后，HCC-042患者的CTC评分显著下降，术后3wk进一步缩小（图4C）。值得一提的是，在这五位患者中有三位（HCC-042、HCC-058和HCC-075）血液中的AFP由于低于临床检测的最低值（<20ng/ml）而没有检测到。因此，尽管血清AFP蛋白经常被用于肝癌患者的筛查，但是其检测率很低。CTC-iChip系统极有可能成为一个更好地筛查、评价肝癌的一个检测手段。

图4.CTC评分较血液AFP检测系统能够更灵敏、更特异地检测肝癌及监控肝癌的治疗情况。

微流控CTC-iChip系统的应用

介于CTC-iChip系统的无创伤、高灵敏性、高特异的优点，可以应用到：

1）大规模的筛查肝癌

2）实时监控肝癌的治疗效果

3）评价肝癌的复发，痊愈情况

小结

全世界半数左右的肝癌病人集中在中国，占我国恶性肿瘤死亡率的第二位。肝癌早期诊断难，大多数HCC患者确诊时一般已是中晚期；复发后转移率高。假如能够做到“早发现、早治疗”肝癌的死亡率可能会大大降低。微流控CTC-iChip系统已经广泛应用于其他癌症的筛查。随着技术的进一步完善，希望该技术能够用于肝癌的筛查、实时监控肝癌的治疗及治疗疗效的评价将极大提高肝癌的防治水平。

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