常见组织细胞的培养方法

体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背 景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施 亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下:

第一节 上皮细胞培养

上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于 上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细 胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外 长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜， 因此培养在有胶原的底物上可能利于生长， 另外人或小鼠表皮细胞培养在以 3T3 细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易 生长并可发生一定程度的分化现象。降低 PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加 入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。 以表皮细胞为例， 用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞， 其法如下 （黑 木凳志夫 1981） 

1、 取材： 外科植皮或手术残余皮肤小块， 早产流产儿皮肤更好， 取角化层薄者， 切成 0.5－1 平方厘米小块。 

2、置 0.02%EDTA 中，室温，5 分钟。 

3、换入 0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。 

4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。 

5、取出表皮，剪成更小的块后，置 0.25%胰酶中，37℃，30—60 分钟。 

6、反复吹打，制成悬液。 

7、培养：用 80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。 

8、直接加入培养基（Eagle 加 20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2 温箱培养。

第二节 内皮细胞培养

内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血 管生长因子（TAF）等有很大价值。 研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下： 

1、产后新鲜脐带，无菌剪取 10—15 厘米长一段，如不能立即培养，可于 12 小 时内保存于 4℃。 

2、用三通注射器吸取温 PBS 液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧， 以防液体返流。 

3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为 0.1%的粗制 胶原酶，充满血管，消化 3—10 分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。 

4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温 PBS 轻轻反复冲洗后，一 并注入离心管中（此步骤可重复） 。

5、离心去上清，加入 RPMI1640 培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温 箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

第三节 神经细胞培养

神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加 入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象， 但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。 人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可 形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自 发转化， 但对外界因素仍保持很好的敏感性， 可用 ROUS 病毒和 SV4 等诱发转化。 设备： 无菌操作设备。 

一、设备 培养箱：恒温 5%、10%CO2 维持培养液中 pH 值。 

二、大型设备 CO2 培养箱 倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况。 解剖显微镜，用于准确地取材。 常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶。 低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂。 电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿。 高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械。 过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌。 渗透压仪，pH 剂，天平等。 

三、培养器皿及手术器械 1、培养皿：常用 35mm 塑料及玻璃皿，解剖取材用 15mm-90mm 直径。 2、培养板，24-40 孔，可用于开放培养。 3、培养瓶： 4、吸管，常用 1，5，10ml，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。 5、各类培养液贮存器。 6、小型手术器械。 

准备： 

一、配制培养液 解剖液： （1）解剖液：以无机盐（去除 Ca2+ , Mg2+）加葡萄糖配制成 PBS 缓冲液，保 持一定的渗透压和 pH 值。 基础培养基（MEM） ：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。 （2）基础培养基（MEM） ： 接种培养液： （3）接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为 MEM 含 1%谷氨酰胺，另加入 10%马血清，当天配制。 维持培养液：接种后 24h，全部换成此液，后每 2 周换一次，每次换 1/2。 （4）维持培养液 其成分为 MEM 中含 5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。 

二、培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶 消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗 2-3d，达两次 ddH2O，每遍 三、消毒培养皿的备用 洗刷 3-4 次，加塞包装，置于烤箱中干燥消毒，于培养前 1 天进行。 神经细胞分散培养 

（一）选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄 6-8d，新生鼠或胎 鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以 19d 为宜， 小鼠以 18d 为宜，大鼠纹状体以 10d 为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚， 则黑质以 13d，纹状体 18-21d 为宜；小脑以 20-21d 小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与 DRG 联合培养，常用 4-7d 鸡胚或 12-14d 小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。  

（二）取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固 定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。 

（三）细胞分离与接种 细胞分离与接种。神经组织用 0.125-0.25%胰蛋白酶在 37℃孵育 30min， 移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充 分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于 培养皿（1×106） ，做电生理应为 5×105 或更低。 

（四）抑制胶质细胞生长 或 5-FU 抑制神经胶质细胞的生长。 抑制胶质细胞生长。培养 3-5d 后，也有人认为培养 7d 后，用阿糖胞苷。 

（五）观察。接种 6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d 胶质细胞增生明显，7-10d 胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2 周时神 经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形， 甚至出现空泡，一般培养 2-4 周最宜。 但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而 且随培养时间的延长， 细胞数量在下降， 但胶质细胞可以， 神经胶质细胞也可以。 在培养过程中，早期 9-12d 时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段， 应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成 突触。 常用培养细胞实验有： 

（六）常用培养细胞实验有：FCM 的蛋白总量分析；膜片钳与离子通道的分析； 免疫组化分析； 但免疫组化分析应注意，由于抗体直接作用于活细胞，不易穿透活细胞，故对核 内抗原定位时，首先考虑膜对抗体的通透性问题。常用化学试剂以增加其通透性 或采用冰冻方法解决。 在免疫组化中，或其它组织学染色中，常用不同的染色方法以区分不同细胞，如 半乳糖脑苷脂对小树突胶质细胞标记明显；GFAP 对星形胶质细胞具有特异性染 色等。这对研究神经系统中胶质细胞功能具有极大的应用价值。神经胶质细胞以 往多被忽视，其在脑血管疾病（如缺血性损伤） 、退行性疾病（如 AD、PD） 、损 伤后胶质细胞的填充等具有不可忽视的作用。 它也是神经细胞功能和营养支持的 物质基础。

第四节 肌组织细胞培养

各种肌组织均可用于培养，以心肌和骨骼肌较实用。 

（一）骨骼肌细胞培养 

1、出生 1 一 2 天的乳鼠，引颈处死。 

2、无菌取大腿肌组织，切成 0.3 一 0.5cm2 小块后，用不含钙镁离子的 Hanks 液配的 0.25%胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过。 

3、计数调整细胞密度。 

4、快接种量 2×106/皿入培养基培养。 

5、培养基内含 10%小牛血清，可加 1%的胎汁以促进分化。 接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化，明胶配置：用 Hanks 液配成 0.01% 明胶。 该细胞接种率约 50%，细胞生长开始呈纺锤形，培养 50－52 小时后出现融合形 成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时可观察到横纹，一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。 

（二）心肌细胞培养 

心肌细胞是最早的培养材料，Carrel 曾长期培养过心肌组织，至今心肌仍不失 为好的培养物，最常用的是鸡胚心肌。 心肌比较容易培养和生长，可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法，均可获良 好的效果。取心室肌培养较好，原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，培养成功时，一 周后可见节律性收缩现象。

第五节 巨噬细胞培养

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的 重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细 胞群，在条件适宜下可生活 2－3 周，多用做原代培养，难以长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难 以建株。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞， 以小鼠腹腔取材法最为实用， 其法如下： 1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 lml（勿注入肠内！，以 ） 刺流产生大量的巨噬细胞。 2、引颈处死小鼠。 3、手提鼠尾将其全浸入 70%乙醇中 3－5 秒。 4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁， 把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。 5、用 70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中，同时用手指从 两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。 6、 用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧． 使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。 7、小心拔出针头，把液体注入离心管。 8、4℃下 250g 离心 10 分钟后，去上清，加 10ml Eagle 培养基。 9、计数细胞。每只鼠可产生 20 一 30×106 细胞，其中 90%为巨噬细胞。 10、以 3×105 个贴附细胞/平方厘米接种。 11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用 Eagle 液冲洗 1 一 2 次，再加新 Eagle 培养液置 CO2 温箱中。 

第六节 肾小球分离、移植培养

SD 大鼠颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡 1～2 分钟，2 次，置超净台内，打开腹腔 取出肾脏剪碎，置含 Hank's 液的无菌培养皿洗涤，置 80 目不锈钢筛网上。用扁 平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网，滤过组织 Hank's 液混合物用吸管 吸至 120 目不锈钢筛网，滤过，去小组织块，滤过物吸至 200 目不锈钢筛网，轻 轻滤过， Hank's 液洗涤 1 次， 收集网上肾小球， 镜下观察为分离良好的肾小球。 肾小球用 0.2%胰酶、0.1%胶原酶，37℃消化 20 分钟，加血清终止胰酶反应，离 心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至 24 孔培养板或 25ml 培养瓶，使肾 小球大于 60 个/cm2，加培养基 5～10ml（培养基组成：F12—3T3 上清 1：1；5% 马血清；2.5%胎牛血清；胰岛素 5μg/ml；25ng/ml 氢化可的松；5μg/ml 转铁 蛋白；25ng/ml 前列腺素 E1；甲状腺素 0.02ng/ml；D-缬氨酸 150ng/ml）肾小球培养 8～10 天，去除肾小球未生长组分，细胞继续培养 24 小时，形态学观察： 细胞生长成单层多角型细胞，直径约 100μm。

第七节 裸小鼠移植瘤单细胞分离培养

无菌条件下取出小鼠移植瘤组织，剪成 1mm3 小块，用 0.5%胶原酶室温消化 30 分钟到 1 小时，再加等体积 0.2%胰酶消化 5～8 分钟，在消化过程中用吸管吹打 组织块或用自制装置 （分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接 而成，滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞）来回推动注射器吹打组 织以分离单细胞，终止酶消化方法同上。 常规方法接种培养收获细胞。