DNA纳米光刻构建高度有序的微流控纳米界面
大家好！今天跟大家分享一篇我们课题组最近发表在Angewandte Chemie International Edition的文章，题目为 “DNA Nanolithography Enables Highly Ordered Recognition Interface in Microfluidic Chip for Efficient Capture and Release of Circulating Tumor Cells”。作者设计了一个顶点悬垂核酸适体的四面体DNA纳米结构，其作为具有纳米精度的识别元件，可通过化学修饰的方法锚定到确定性侧向位移(DLD)模式的微流控芯片上，然后实现循环肿瘤细胞(CTC)的高效捕获和释放，并通过数字液滴PCR扩增技术进行下游基因突变分析。
【背景介绍】
随着微加工技术的发展，微流体技术的应用取得了重大的进展。纳米级微流控芯片展示出巨大的应用潜力，纳米-微米结构构筑的跨尺度界面，可不受传质阻力的限制，从而改善界面上分子识别的动力学和热力学。尽管已经开发出多种用于微米级结构的制造方法，但可重复地制备具有高精度尺寸的纳米级结构在技术上仍然具有挑战性。例如电子束光刻和纳米压印技术等虽可制备高分辨率纳米结构但由于依赖大型昂贵设备及多步处理步骤，限制了其广泛应用。
核酸适体是一条单链的DNA或RNA，能自发折叠成特异的三维结构以实现高亲和力、高特异性识别靶标分子。与抗体相比，核酸适体用于CTC分析，显示出许多独特的优点，如良好的物理稳定性、低成本、易于改造修饰且批次间差异很小。目前已开发核酸适体的CTC微流控体系，大多是通过物理吸附、化学反应或生物分子识别将核酸适体连接到基质界面。然而，核酸适体的结构会受到链间缠绕以及适体与芯片界面之间非特异性相互作用的影响，在很大程度上限制了核酸适体对CTCs上所表达标志物的识别作用，致使目前适体微流控芯片对CTC捕获效果不理想。
DNA分子由于其精确和可编程的核苷酸碱基配对原则，可以精准组装成多种形状、大小和尺寸的DNA纳米结构。其中，四面体DNA纳米结构（TDN）可作为定向修饰识别分子的刚性框架，有望作为功能分子和微流控界面之间的桥梁，避免常规微流控界面上核酸适体修饰产生的不良取向或拥挤效应，实现功能分子的均匀垂直界面修饰。
【设计思路】
作者首先设计了一个顶点悬垂核酸适体SYL3C(针对CTCs标志物上皮细胞黏附分子（EpCAM)）的四面体DNA纳米结构（SYL3C-TDN），然后通过化学修饰的方法锚定到确定性侧向位移(DLD)模式的微流控芯片(ApTDN-Chip)上 (如图1)。刚性的四面体DNA框架通过“DNA纳米光刻”，可实现核酸适体呈高度有序且直立的纳米形貌排布，有利于适体对CTC的识别作用。而DLD芯片通过尺寸选择，可提高CTC与微柱之间的碰撞效率，同时最大程度地减少血细胞与微柱之间的碰撞。此外，四面体DNA支架还通过在界面上合理的空间间距降低了核酸适体的局部拥挤效应，使DNA核酸酶(DNaseⅠ)更易于与核酸适体作用，从而实现捕获后细胞的有效释放。最后可利用数字液滴PCR技术对释放的CTC开展下游分子生物学分析。
图1. ApTDN-Chip的工作原理
【数据介绍】
SYL3C-TDN由一条含有核酸适体SYL3C片段的DNA长链（Apt-A）和三条DNA单链一步合成得到，与TDN有相似的高产率（超过85%），且重现性好。如图2A、B所示，SYL3C-TDN 能够维持核酸适体SYL3C特异性识别EpCAM表达阳性的SW480细胞系的能力，同时避免非特异性吸附。为了验证TDN作为纳米支架在界面上的优势，作者将不同浓度的SYL3C-TDN和SYL3C通过链霉亲和素和生物素作用修饰到磁珠上，然后投入相同数量的SW480细胞系。通过分析靶细胞的回收率，可以得到界面上SYL3C-TDN的平衡解离常数（Kd）为7.11 ± 0.98 nM（图2D），相比于界面上SYL3C的亲和能力降低了4倍（Kd=30.46 ± 3.20 nM，图2C）。此外，在均相溶液中，SYL3C-TDN表现出与SYL3C相似的亲和能力。由此可见，四面体DNA支架能够提高核酸适体在界面上的识别热力学。
图2. SYL3C-TDN识别能力的探究
为了进一步探究微流控芯片中DNA纳米界面对于提高细胞捕获效率的作用，作者设计了四种不同类型的微纳界面（图3A）。其中，生物素标记的DNA通过链霉亲和素修饰到微流体界面是常用的芯片修饰策略。然而，链霉亲和素以无序的形式随机固定在微流体界面上，使得DNA以一个取向杂乱的状态存在，这大大降低了DNA分子识别效率。而TDN作为分子支架，为核酸适体提供直立的取向和可控的间距，使得ApTDN-Chip展示出较高的捕获效率（在缓冲液中87.4%），与另外三种微纳米界面相比，捕获效率提高了20-60%（图3B）。此外，ApTDN-Chip在模拟病人血样中仍保持较高的捕获效率。同时，ApTDN-Chip对于白细胞和EpCAM表达阴性的Ramos细胞系的非特异性吸附与另外三种微纳米界面是相似的（图3B、C）。
图3.核酸适体不同微纳米界面修饰的性能探究
高效无损释放CTCs对于下游分析十分重要。近年来，研究人员开发了多种用于核酸适体的微流控芯片的释放方案，如热裂解、互补序列杂交和核酸酶水解。然而，它们的释放效率往往会因为界面上局部拥挤效应或识别分子和界面的非特异性吸附，难以达到理想效果。基于此，四面体DNA支架为SYL3C-TDN在界面上提供合理的空间间距，能减小局部分子拥挤效应，使得DNaseⅠ更好的水解DNA序列。如图4A，ApTDN-Chip中捕获后的肿瘤细胞几乎80%会被释放，比Apt-Chip的释放效率高约30%。这一释放策略是通过水解核酸适体实现靶细胞的释放，因而非特异性吸附的白细胞大部分仍留在微通道表面，使得释放后CTCs的纯度能够进一步提升（图4C）。此外，如图4D、E所示，释放后的细胞活性仍保持较高的水平（90.8%），有利于后续下游分子生物学分析。
CTC携带突变基因信息，在精准医学中是一个潜在的生物标记物，例如一些对表皮生长因子受体（EGFR）抗体治疗产生耐药性的病人往往会存在KRAS基因突变，而随着肿瘤的发展，KRAS突变也会随之发生改变。因此，作者通过数字液滴PCR技术可对回收后的CTCs进行KRAS突变检测。模拟病人样本验证ApTDN-Chip的捕获-释放策略，可检测出低至每毫升20个 SW480细胞所携带的KRAS基因突变信息，检测出每微升15.4的拷贝数（图4F、G）。此外，ApTDN-Chip技术也被应用于病人外周血CTC捕获及下游KRAS基因突变检测，突变检测结果和临床组织穿刺结果具有良好的一致性。
图4. ApTDN-Chip下游分析探究
【总结】
本文展示了“DNA纳米光刻”用于构建有序微流控芯片识别界面的潜力。刚性的四面体DNA支架为核酸适体提供高度有序的直立方向和可控间距，从而促进核酸适体在界面的有效识别。与传统的纳米级微流控界面加工方法相比，该平台易于制造并表现出优异的性能。这种具有高精度尺寸的纳米级框架结构作为识别分子和微流控界面之间的桥梁，改善了识别分子在界面修饰上的分子识别的热力学。利用“DNA纳米光刻”实现微流控界面功能化有望用于许多领域，如无创产前检测、循环肿瘤外泌体和各种生物标记物的检测以及细胞行为调控。
该工作由课题组和上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科联合攻关完成。2018级硕士研究生张佳露为论文的第一作者，宋彦龄、杨朝勇及胃肠外科赵刚为本文共同通讯作者。
撰稿人：张佳露（硕士生）
校稿：宋 佳
原文链接:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202005974
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