基于液滴模式的微流控细胞筛选系统

基于液滴模式的微流控细胞筛选系统

自2001年Quake研究组提出液滴微流控的概念以来,液滴微流控技术得到了长足发展,在高通量药物筛选领域也得到了广泛应用。基于液滴模式的微流控系统利用互不相溶的两相形成pL至nL级包裹细胞的液滴,在液滴中完成细胞的培养和对细胞的药物刺激等操作。这类系统可以在短时间内形成大量细胞液滴,提高实验的通量,并可有效降低试剂的消耗量,但液滴反应器的使用同时也对液滴内营养物质的更新和细胞代谢物的清理提出了挑战。

Clausell-Tormos等首次建立了可实现细胞生长的液滴微流控系统,以添加了表面活性剂的氟油(FC40)为连续相(continuous phase),细胞悬浮液为分散相(dispersed phase),生成了FC40包裹的细胞液滴。FC40具有良好的生物兼容性和透气性,因此能够使得细胞在液滴中正常生长。该研究组分别以白血病T细胞(jurkat)和肾细胞(HEK293T)作为悬液细胞和贴壁细胞的代表,证明了即使在液滴体积仅为660 pL的条件下,3 d后细胞的存活率仍能达到80%。

除了产生大小均一的液滴,能够对液滴进行精准操控是实现细胞分析的必要条件。Brouzes等构建了一种集成化的液滴微流控系统,用于高通量单细胞药物筛选(见图4a)。首先利用光学编码技术对不同的药物液滴进行标记,形成化合物库,再在电场的作用下将药物液滴和单细胞液滴顺序融合、收集,孵育24 h后将其重新注入微流控芯片中,并将其与含有细胞活性分析试剂的液滴再次融合,对药物刺激结果进行检测分析。Kulesa等同样利用电场融合液滴的方法设计了一套适用于组合药物筛选的微流控芯片系统。在该系统中,细胞悬浮液、不同的药物溶液和特异性荧光染料被预先混合并乳化为液滴,这种荧光染料能够分别在不同的激发光下实现对药物的识别和细胞活性的检测。之后将得到的液滴注入PDMS微坑芯片中,由于微坑的独特结构,每个微坑能够同时捕获两个液滴,两个随机被捕获的液滴在电场作用下融合,进行药物对细胞的刺激实验(见图4b)。利用该系统评估了4000多种药物与10种抗生素对大肠杆菌(Escherichia coli)的联合作用,成功发现了多种之前未被报道的协同组合。Wong等设计了一种PDMS通道芯片,用于形成细胞液滴进行药物筛选(见图4c)。

图 4   基于液滴模式的微流控细胞筛选系统

每个单通道包含48个细胞培养腔室,当细胞样品从通道入口流入时,由于腔室(well)之后通道(restriction)的限制压力,流体只能进入腔室区域和旁路通道(bypass);随后再通入油相,由于腔室之前通道(neck)的限制压力,油相无法进入腔室,从而截断流体,即可依次在腔室中形成细胞液滴。在该系统中,一个通道中平均截留80000个细胞,用以筛选5种药物作用条件,对于贴壁细胞和悬浮细胞均可适用,可实现在肿瘤切除24 h内,快速、低成本地筛查原发性肿瘤癌细胞。

为了更好地模拟体内肿瘤细胞,目前已经发展了多种基于3D细胞培养的液滴微流控系统。Wang等将HeLa细胞包裹在由藻酸盐和基质胶混合得到的水凝胶液滴中,形成细胞球(见图5a),之后使用长春新碱(vincristine)对细胞球进行刺激。实验结果表明,相比于传统单层培养的细胞,肿瘤细胞球具有更明显的耐药性。Sun等开发了一种生成具有核-壳结构的藻酸盐微粒的方法,之后将乳腺癌细胞(MCF-7)和成纤维细胞(human mammary fibroblasts)分别封装在藻酸盐微粒的核与壳中,建立3D共培养的肿瘤模型,模拟体内微小的肿瘤组织(见图5b)。利用该共培养肿瘤球体测定了姜黄素和紫杉醇(paclitaxel)两种抗癌药物的细胞毒性,显示出与常规孔板方法结果相似的肿瘤球耐药性。该方法可快速形成大小一致但组成不同的各种肿瘤球体,应用于大规模抗肿瘤药物的筛选,同时也为细胞的共培养模式提供了新思路。作者所在研究组发展了一种在PDMS基片的侧壁上形成细胞球的方法,通过序控液滴阵列(SODA)技术控制毛细管探针在基片侧壁依次形成细胞悬液的悬滴,并稳定地附着在侧壁上,最终培养形成了HepG2细胞球,并完成了阿霉素对细胞球的刺激实验(见图5c)。这种方法的优点在于不仅可以实现细胞的3D培养,还使得悬滴的上方和下方均处于开放的状态,可以方便地完成后续的药物加入、细胞染色以及细胞观察等操作。

图 5   基于3D细胞培养的液滴模式微流控细胞筛选系统

基于微阵列模式的微流控细胞筛选系统

基于微阵列模式的微流控细胞筛选系统是指在能够适应细胞培养的载体上,通过一定的手段生成细胞液滴阵列,并对细胞液滴阵列进行操控和分析。这类系统能够通过扩大液滴阵列的规模在单次实验中同时筛选大量不同的样品,而且容易实现对细胞液滴阵列的整体操控以提高筛选效率,但同时这些操作的实现也依赖于高精度且配套的液体操控设备。

Lee等构建了一种名为水凝胶液滴阵列(DataChip)的微阵列芯片系统(见图6a),并应用于高通量药物筛选实验中。首先利用凝胶打印机在经过处理的玻璃表面生成含有乳腺癌细胞(MCF-7)的水凝胶液滴阵列进行孵育培养,然后将预先制备的药物凝胶阵列(MetaChip)贴合于细胞凝胶阵列上完成药物刺激实验。该系统最多可集成1080个不同条件的液滴阵列,药筛结果与传统的基于96孔板的方法所得到的实验结果相近,但药物消耗量可以降低约2000倍。之后该研究组还提出了通过在微柱阵列芯片的微柱上形成水凝胶细胞液滴用于药物筛选的方法。

图 6   基于微阵列模式的微流控细胞筛选系统

微坑阵列因为易于加工、通量高,在形成细胞液滴阵列上应用非常广泛。Wu等[68]利用聚乙二醇(PEG)微坑阵列芯片和PDMS微柱阵列芯片构建了一种夹心结构的微流控细胞筛选系统(见图6b)。先通过点样仪将不同的药物沉积在PDMS微柱阵列上,之后插入接种了细胞的PEG微坑中,实现对细胞的药物刺激。尽管该微坑/微柱阵列芯片仅为普通载玻片大小,但单次可完成2100个测定。利用该系统测试了320种天然化合物对乳腺癌细胞(MCF-7)的化学毒性,还进行了P-糖蛋白(P-glycoprotein)与天然化合物的组合检测,成功筛选出能够增强对MCF-7细胞抑制作用的组合。Li等设计了类似的微坑/微柱结构装置。直接以1536孔板提供微坑,制备互补的PDMS微柱,并将其连接到1536孔板的板盖上,加药时翻转板盖对准孔板使微柱插入孔中。通过荧光检测药物与乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的相互作用,获得了抑制MDA-MB-231细胞活性的先导单一药物以及具有协同作用的药物组合。Chong等设计了一种由同心细胞腔室单元组成的微坑阵列芯片,用于细胞的共培养(见图6c)。每个同心细胞腔室单元由中心腔室和环形腔室组成。肝细胞球体(HepaRG)和U937免疫细胞分别被接种在中心腔室和环形腔室中,经过肝代谢后的活性代谢物通过腔室之间的微通道扩散至邻近的免疫腔室中。通过检测免疫细胞的活化程度,测试了3种药物的致敏性,表明了与传统细胞迁移腔室(Transwell)培养方式相比,该芯片可以更好地区分皮肤过敏的致敏药物和非致敏药物。

利用表面张力来形成细胞液滴阵列也是常用的一种方法。通常会选择对芯片表面进行选择性修饰,改变芯片表面特定区域的亲疏水性质,使得细胞悬液被截留在特定区域,从而形成细胞液滴阵列。Popova等开发了一种形成超疏水-超亲水微图案的方法。利用超疏水和超亲水区域的润湿性差别,自发地形成细胞液滴阵列(见图6d)。通过在这些独立的液滴中进行细胞培养,再加入不同的药物试剂,实现对细胞的高通量分析。Zhang等制备了一种由PDMS微坑阵列和超疏水聚合物层组成的超疏水微坑阵列芯片。除了能用来接种细胞液滴,还可以快速实现整个液滴阵列的培养基更换,因此该系统兼容于贴壁细胞和悬浮细胞。

作者所在研究组也将SODA技术应用于构建细胞液滴阵列中,发展了一种基于细胞液滴微阵列的药物筛选系统。得益于SODA技术对液体的灵活操控能力(包括液体的量取、吸取、转移、注射、混合等),该系统在一块PDMS芯片上完成了药物筛选过程所需要的全部操作步骤,包括细胞接种、第一个药物刺激、第二个药物刺激、细胞荧光标记等。采用每24 h更换一次细胞液滴培养基的方法,在覆盖了氟油(FC40)的500 nL液滴中完成了长达11 d的细胞培养。该系统被应用于3种抗癌药物黄酮哌啶醇(flavopiridol)、紫杉醇和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)对A549细胞的药物联用组合筛选中(见图6e),得到了产生最佳抑制效率的药物组合。

总结与展望

高通量药物筛选是现阶段药物开发的主要途径。微流控技术的出现使生化反应可以在微加工的通道、腔室或nL级甚至是pL级的液滴中进行,这在很大程度上改变了传统高通量筛选系统的工作模式,引起了人们的广泛关注,使得基于微流控技术的细胞筛选系统得到了快速发展,展现出突出的研究潜力和应用价值。

尽管微流控技术在试剂消耗、筛选通量、细胞培养微环境控制等方面与常规方法相比已经展现出明显的优势,但仍然有很大的发展空间。目前文献报道的大部分微流控细胞水平高通量药物筛选系统仍处于实验室研究阶段,尚未达到商品化和通用化的程度。多数系统还难以在超微量和高通量水平下,完成从细胞阵列的形成、培养到加药和检测等全过程操作的自动化。如何自动实现有限细胞的精准量取与分配,如何精准地控制批量微反应器内的细胞培养条件,如何自动实现大规模具有不同组成和浓度药物的加入和刺激,以及如何自动实现筛选结果的快速高通量检测等,是下一步在实现微流控细胞水平高通量药物筛选系统实用化中应该重点解决的问题。此外,目前的微流控系统构建的细胞培养环境与实际体内细胞的微环境还有较大差距。为了能够提高药物筛选结果的准确性,目前研究者们已经不局限于传统独立细胞的培养模型,而是通过构建各种不同结构的器官芯片来进一步模拟人体组织和器官的功能,包括实现细胞的共培养、血液的流动以及物质的传输等,以此来提供一个更加接近人体真实生理和病理条件的研究模型,这也将是今后该领域的重点发展方向之一。

总之,微流控药物筛选系统发展的最终目的是为了减少药物开发过程中对动物实验的需求,甚至是部分替代动物实验,以促进更大规模、更高通量,同时更安全、更有效的药物开发。虽然这还有很长的道路要走,但随着微流控技术的快速发展,微流控细胞水平的高通量药物筛选系统一定会得到进一步完善,实现更为强大和复杂的功能,成为推进全自动药物开发的重要力量。

免责声明：文章来源DOI: 10.3724/SP.J.1123.2020.07014  以传播知识、有益学习和研究为宗旨。 转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除。