基于微流控技术的细胞水平高通量药物筛选系统的研究进展上

药物筛选是新药研发的关键步骤,创新药物的发现需要采用适当的药物作用靶点对大量化合物样品进行筛选。高通量筛选系统能够实现数千个反应同时测试和分析,大大提高了药物筛选的实验规模和效率。其中基于细胞水平的高通量药物筛选系统因为更加接近人体生理条件,成为主要的筛选模式。而目前发展成熟的高通量细胞筛选系统主要基于多孔板,存在细胞培养条件单一、耗时费力、试剂消耗量大等问题,且较难实现复杂的组合药物筛选。微流控技术作为一种在微米尺度通道中操纵和控制微流体的技术,具有微量、高效、高通量和自动化的优点,能较好地克服多孔板筛选系统的不足,为构建细胞高通量药物筛选系统提供了一种高效、可靠的技术手段。微流控系统在细胞培养材料、芯片结构设计和流体控制方面均可灵活变化,能更好地实现对细胞生长微环境的调控和模拟。文章综述了基于微流控技术的细胞水平高通量药物筛选系统的研究进展,按照不同的微流体操控模式,对基于灌注流、液滴和微阵列的3种类型的微流控细胞筛选系统进行了分类介绍,并分别总结了它们的优缺点,最后展望了微流控细胞水平高通量药物筛选系统的发展前景,提出了该领域目前存在的问题以及解决问题的方向。

药物筛选是指从天然产物或者人工合成的化合物中筛选出具有生物活性的新药或者先导化合物,是新药研发过程中的关键步骤。创新药物的发现需要采用适当的药物作用靶点对大量化合物样品进行筛选。而随着基因组学、蛋白质组学、代谢组学、组合化学等学科的发展,药物分子库在不断扩大,药物作用靶点也越来越多,这使得药物发现的范围逐渐扩大,药物筛选的工作量急剧增加。因此高通量筛选(high-throughput screening)技术应运而生。高通量筛选系统以分子水平或细胞水平的实验方法为基础,通过自动化操作系统、灵敏快速的检测系统和数据分析系统能够实现数千个反应同时测试和分析,大大提高了药物筛选的实验规模和效率。基于细胞水平的药物筛选系统因为更加接近人体生理条件,实验准确率更高,成为主要的筛选模型。

目前已经发展成熟的细胞高通量筛选系统主要是基于多孔板进行的。它们利用自动化的液体转移分配机械臂完成对液体的多步操控和试剂运输,并使用多孔板扫描仪或者自动化显微镜扫描拍摄技术对细胞的生存情况进行检测。但是这些自动化设备的价格相对较高,不利于普通小型的研究中心或实验室使用。另外,用于药物筛选的生物样品和药物库的成本也较高,而目前常规液体处理设备能够准确操控的液体体积在数百纳升水平。

微流控技术是近年来的研究热点之一,其核心是将常规化学、生物等领域所涉及的基本操作单元集成到方寸大小的芯片上,实现对nL级至pL级液体的精准操控,在化学、生物学、医学等领域都具有广泛的应用。利用微流控技术可以构建高通量、低成本细胞水平的药物筛选系统,系统具有样品及试剂消耗量少、系统高度集成化和自动化等优点。同时,微流控芯片与传统的细胞培养器皿相比,在细胞培养上也具有诸多优势。如通过选择不同的芯片材料或者设计不同的细胞培养腔室结构,更容易实现细胞的三维(3D)培养。因此,基于微流控技术的细胞筛选系统是一种极具潜力的药物筛选系统。

在微流控细胞筛选系统中,通常会涉及细胞的接种、培养液的更换或添加、药物的加入与清洗、细胞染色试剂的添加等操作,这些操作均需通过对微流体的操控得以实现。按照微流体操控模式的不同,可将微流控细胞筛选系统分为3类,分别是灌注流模式、液滴模式和微阵列模式。

基于灌注流模式的微流控细胞筛选系统

基于灌注流模式的微流控细胞筛选系统,通过控制流体连续流过微通道,将细胞接种在微通道中的细胞培养腔室,并完成对细胞的药物刺激。流体的驱动力主要有外部机械泵驱动、电渗驱动、重力驱动以及表面张力驱动等方式。这类系统的优势在于容易实施,并适用于不同的细胞检测方法,如荧光检测、吸光度检测、电化学传感器实时检测,以及通过质谱对细胞代谢物或其他生物标志物进行检测。这类系统的局限性主要有:利用微通道进行连续流体输送易导致较高的试剂消耗;当被应用于大规模的药物筛选时,芯片结构通常比较复杂,涉及多种通道、液体控制泵和阀门的设计。

Wang等设计了一种基于灌注流模式的微流控芯片,用于正交化的药物筛选(见图1a)。芯片在水平和垂直两个方向上分别加工有24条通道,通过在芯片中集成气动弹性微阀实现对垂直通道和水平通道的分别控制,完成不同类型的细胞接种和不同药物对不同细胞的正交化刺激。利用该芯片测试了洋地黄皂苷(digitonin)、皂角苷(saponin)、丙烯醛(acrolein)、氯化钴(CoCl2)和氯化镍(NiCl2)5种物质分别对于小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/3T3)、HeLa细胞和牛内皮细胞(bovine endothelial cells)的毒性作用,实现了高密度平行的药物筛选。Park等在类似的芯片结构上设计了桥连式的微通道来输送细胞和药物(见图1b),研究了细胞外基质与可溶性转化生长因子-β1对二型肺泡上皮细胞(ATII)表型的影响。这种方法不仅可以提高对目标细胞腔室寻址的灵活性,还能减少流体剪切力对细胞的影响。

图 1   基于灌注流模式的微流控细胞筛选系统

显著的层流效应是灌注流体系的主要特征之一,利用该效应可以在微通道内形成具有较高重现性和稳定性浓度梯度的液流,这类系统被广泛应用于细胞高通量药物筛选中。Ye等将浓度梯度药物形成与细胞培养这两个单元集成到一个圆盘芯片中(见图1c)。该芯片含8个具有相同结构的单元,每个单元在上游包含一个“圣诞树”结构的浓度梯度生成器,下游平行连接多个细胞培养腔室,单次可产生64种药物作用条件,实现了对阿霉素(doxorubicin)诱导肝癌细胞(HepG2)凋亡过程的监测。An等将两个相似结构的浓度梯度生成器与细胞培养腔室正交连接,评估了姜黄素(curcumin)和肿瘤坏死因子-α相关诱导凋亡配体对前列腺癌细胞(PC3)的联合治疗效果。

为了扩大药物浓度梯度范围,Zhang等设计了一种非对称流体通道结构的浓度梯度生成器,用于生成具有对数级浓度混合比的药物组合。3D打印技术由于能够制造结构复杂且相互连接的微流体通道,因而被用来加工用于溶液混合的微流控芯片。Chen等利用3D打印得到了具有三维立体螺旋结构的浓度梯度生成器(见图1d),并测试了4种药物的36种浓度组合对肺癌细胞(A549)的抑制作用。

基于微通道表面的二维(2D)细胞培养模式缺乏细胞生长分化所需的多层次微环境,例如细胞和细胞之间以及细胞和基质之间的相互作用,这可能会导致筛选得到的药物在被应用到临床试验时,治疗效果产生较大偏差。3D细胞培养模式因为可以提供更加接近体内条件的微环境,而吸引了越来越多研究人员的关注。如图2a所示,Patra等通过对聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片进行预处理,使细胞不能贴壁生长,从而在腔室中形成细胞球并进行药物刺激。该研究组研究了顺铂(cisplatin)、白藜芦醇(resveratrol)和替拉扎明(tirapazamine)3种药物对不同大小的HepG2细胞球的影响。实验结果表明,细胞球的大小和细胞的培养模式(2D和3D)对药物刺激结果均有明显的影响。Toh等报道了一种基于3D肝细胞培养的微流控芯片系统(见图2b)。通过在芯片的通道中央加工两排并列的微柱阵列来固定肝细胞,维持肝细胞的3D形态和代谢功能,之后由两侧平行通道引入不同的药物刺激肝细胞,实现对肝细胞的高通量药物毒性测试。Mulholland等发展了一种微流控平台,该平台直接利用肿瘤活检中获得的富含癌细胞的多细胞球体进行药物筛选,能够提高筛选结果的准确性。Pandya等将电化学传感器集成到微流控细胞筛选系统中,通过叉指微电极实时检测3D凝胶基质中植入的癌细胞对不同药物的敏感性(见图2c)。这些数据可以潜在地预测患者对于不同化疗方法的反应,从而选择出最佳治疗手段,改善癌症治疗效果。

图 2   基于3D细胞培养的灌注流模式微流控细胞筛选系统

随着微流控技术的不断发展,多种能够用于模拟人体不同器官及组织间相互作用的器官芯片(organ-on-a-chip)系统已经被报道,包括肺芯片、肾芯片、脑芯片和肠-肝-肿瘤芯片等。这些器官芯片系统大部分是基于灌注流模式构建。Huh等构建了一种具有一定仿生功能的肺芯片(见图3a)。该芯片中,在上下两个PDMS通道之间加工有PDMS多孔膜,PDMS多孔膜上下两侧分别接种肺泡上皮细胞和内皮细胞,肺泡上皮细胞暴露在空气中模拟肺泡的空隙,培养基从下方通道注入模拟毛细血管,通过循环施加真空带动膜的往复运动模拟肺的呼吸。该研究组将白细胞介素-2(interleukin-2)添加到培养基中,再现了其导致肺水肿的药物毒性,并观察到血管生成素-1(angiopoietin-1)以及一种新的香草酸受体4的离子通道抑制剂(GSK2193874)能抑制其药物毒性。Liu等设计了一种微通道芯片用于模拟肿瘤诱导的血管生成(见图3b)。芯片包含6个独立的血管生成单元,每个单元由一个开放式的细胞培养腔室和腔室两侧的血管生成通道组成。通过观察内皮细胞在肿瘤细胞诱导下的迁移和血管生成过程,研究了不同的抗血管生成试剂对内皮细胞迁移的抑制作用。Oleaga等构建了一种包含心脏、肌肉、神经元和肝脏细胞的多器官芯片(见图3c)。通过重力驱动培养基在不同细胞腔室之间循环流动,实现对细胞的动态培养和药物刺激过程。在芯片上测试了5种药物的细胞毒性,得到的结果与已被公布的动物实验毒性结果基本一致。

图 3   基于灌注流模式的器官芯片系统

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