基于微流控技术的循环肿瘤细胞分析研究进展
癌症的精准诊疗是提高癌症患者生存率和生存质量的重要手段。液体活检通过采用非侵入采样方式, 获取肿瘤病人全面、准确、实时的基因组、转录组及蛋白组等生物学信息, 是一种新兴的癌症诊断技术, 对癌症精确诊断、个体化治疗、预后评估等方面具有重要意义。循环肿瘤细胞(CTC)是一种从实体瘤组织脱落进入外周血的肿瘤细胞, 因能提供完整的细胞生物学信息, 是最具应用前景的液体活检靶标。然而, CTC的数量极其稀少、异质性强、所处外周血环境复杂等特点, 给CTC的富集和分析带来了巨大的技术挑战。
上海交通大学杨朝勇教授总结其课题组近年来发展的基于CTC液体活检策略, 着重讨论在CTC识别、富集与单细胞分析等方面的研究进展。相关专题论述在线发表于《中国科学：化学》中文刊。
癌症严重威胁人类的生存健康, 是导致人类死亡的第二大病因。据统计, 2015年全球约有1750万新发的癌症患者, 870万例死亡与癌症相关。癌症的早期筛查、精确诊断和预后监测是提高癌症患者生活质量及生存率的重要手段。作为肿瘤诊断的金标准, 组织活检存在取样难、侵入性大、代表性不全、并发症风险高等不足。
近年来, 针对体液(血液、尿液、胸腔积液等)中的生物标志物包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)、循环肿瘤DNA (ctDNA)、外泌体(exosome)等的检测技术, 即液体活检, 被认为是癌症体外检测的重要发展方向。
与经典组织活检相比, 液体活检技术具有取样方便、侵入性小、信息全面、无放射性污染、成本低等优势, 是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段之一, 已成为当前癌症诊断领域的前沿热点。CTC是从实体瘤组织脱落进入外周血的、完整的肿瘤细胞, 与肿瘤转移密切相关; ctDNA是由肿瘤细胞凋亡释放在外周血中的游离DNA片段, 并携带肿瘤相关的遗传学突变, 能够反应肿瘤组织的突变图谱, 是早期筛查、预后评估的重要监测指标; 外泌体是存在于体内的细胞外囊泡, 包含有肿瘤细胞相关的核酸、蛋白质等, 实现细胞间的信息递送, 近年来被发现外泌体是肿瘤检测的重要靶标之一。
相比于碎片化的ctDNA片段和纳米尺度的外泌体, CTC由于其完整的细胞性质, 不仅能够提供肿瘤病灶的基因组变异、mRNA表达异常、蛋白质组变化等物质信息改变, 还能从细胞形态、迁徙能力、药物刺激响应研究等方面对肿瘤的转移、耐药机制进行研究, 能全面、系统地反映肿瘤病灶的分子病理分型, 因此尤为受到关注。大量研究证明, CTC的检测分析在肿瘤诊断、病程监测、疗效评估、药物开发、个体化治疗等方面具有重大意义。
CTC早在1869年就被Ashworth等发现报道, 但直到20世纪90年代中期, CTC相关研究报道才逐渐增多, 主要原因在于CTC的检测分析存在较多技术挑战。首先, CTC数量极少, 通常1mL外周血中仅含有1~100个CTC, 而血细胞的数量数以亿计。在如此庞大复杂的背景细胞下, 很难实现CTC的高灵敏检测。因此, 发展高效的富集方法是CTC检测分析的关键步骤和重要前提。
目前主要有两类富集方法, 第一类是基于CTC和血细胞尺寸、密度、介电性等物理特性差异, 通过微过滤、离心、介电泳等方法实现CTC的富集。但这类方法存在特异性差、纯度低等不足。另一类是基于CTC和血细胞表面标志物差异, 利用识别分子修饰的磁珠或微纳芯片亲和富集CTC。这类方法具有特异性强、纯度高等优点, 是目前最常用的CTC富集策略。但CTC存在不同的亚群, 无通用标志物; 且有些CTC会发生上皮-间质转化(EMT), 其标志物表达水平处于动态变化中。目前通常采用的上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗体亲和富集CTC的方法, 会“漏检”EpCAM低/不表达的CTC, 也难以实现CTC的分型捕获。因此, 发展高效、特异的新型识别分子, 实现CTC富集和分型分析具有重要的意义。
肿瘤组织内和肿瘤组织间都存在异质性的肿瘤细胞, 来源于实体瘤CTC同样存在较强的异质性。研究表明, 只有少数CTC具有转移能力及肿瘤耐药性突变等。传统以细胞群体为对象的分析方法, 容易掩盖细胞-细胞之间微小的差异, 难以实现CTC肿瘤异质性的研究。因此, 单细胞水平的CTC组学研究具有重要的意义。为实现CTC的单细胞分析, 需要解决两个技术难题: (1) 对富集捕获的CTC实现无损释放, 方便下游培养及表征分析, 获得CTC的真实生物学信息; (2) 建立高通量单细胞分析平台, 精准地挖掘CTC与正常细胞、CTC之间的异质性, 检测CTC的组学变化, 进而推动肿瘤转移机制研究及个体化治疗的发展。
微流控技术是在微米级通道内进行流体控制以实现微量的生物、化学相关实验过程的新兴技术。基于微型化、自动化、集成度高、分析速度快等优点, 微流控技术在CTC分离富集和单细胞分析中具有显著的优势。通过对微通道、腔体的结构设计, 能够针对CTC的物理、生化性质实现特异性分离与富集。另一方面, 通过微孔、卡槽、微液滴等单细胞分散手段的组合, 实现对捕获的CTC进行高通量分散操控, 并提供纳升到皮升的反应空间, 达到对CTC的高效精准单细胞分析, 是极具前景的分离分析技术。
针对基于CTC液体活检的发展和临床应用需求, 上海交通大学杨朝勇课题组从发展新型高亲和力的识别分子、建立高效富集CTC的微流控平台、构筑高通量的单细胞分析方法三个层面解决目前CTC测不准、数不全的难题和单细胞检测分析的需求。近期发表于《中国科学：化学》的文章总结了在核酸适体筛选新策略、CTC高效富集方法及高通量单细胞分析方法的研究进展。
循环肿瘤细胞分析过程示意图
CTC作为液体活检技术中的重要靶标, 已被美国临床肿瘤学会推荐为肿瘤标志物, 可作为肿瘤TNM分期的重要补充。外周血中CTC的个数和生物学信息与实体瘤组织存在一定的量效关系, 因此, CTC个数检测及组学信息分析对肿瘤诊断、疗效监测、预后评估、个体化治疗的临床应用及肿瘤转移及抗药性等机制的研究具有重大意义。然而, 由于其个数少、异质性强, CTC检测分析仍存在巨大的挑战。首先需要选择高通量、高效率的CTC分离富集方法。以免疫识别为核心的富集手段, 虽能实现高效、高纯度的CTC富集, 但是依赖标志物表达的分离方法容易漏掉低表达/不表达的CTC, 而这些CTC往往是侵袭能力的亚群。此外, 免疫识别过程需要考虑到识别分子与细胞之间的作用力, 限制了微通道中的流体速度进而限制了芯片的通量, 另外, 以细胞物理性质差异实现CTC富集的物理分离方法, 虽可以规避免疫识别过程, 提高通量。然而物理分离方法, 一般纯度较低、丢失率较高, 容易漏掉与血细胞有尺寸重叠的CTC亚群, 限制了其临床应用。因此, 结合多种原理, 实现CTC分离富集, 将会是未来CTC分离技术发展的核心思路。
核酸适体作为高特异、高亲合力的识别分子, 虽可通过体外筛选技术获得任何肿瘤细胞靶标的识别分子, 但大量研究表明, 核酸适体在外周血环境中, 容易受到核酸酶、缓冲环境等干扰, 使其稳定性和结合力受到影响。因此, 以外周血等复杂基质为筛选条件的核酸适体筛选方法的开发, 将会大大扩展核酸适体分子在CTC识别富集中的应用。此外, 利用纳米材料、聚合物等提高核酸适体的稳定性, 构建核酸适体多价效应等方式, 也将大大提高现有核酸适体的使用范围。
CTC的数目虽能做为肿瘤分期的补充, 但是CTC本身携带的组学信息更具有研究意义。要实现CTC的下游分析, 首先需要实现CTC的无损释放。已经有不少课题组开发了CTC的释放方法, 如温度响应、核酸酶水解、光切割。这些方法虽在细胞系实验中展示了>95%的释放效率, 但是在临床样本体系, 仍存在释放效率低、损失率高等问题。因此, 亟需发展适用于临床应用的CTC释放方法。
CTC单细胞分析技术是CTC研究的重点方向。CTC单细胞测序方法可以比较CTC与原发灶、转移灶以及转移淋巴结中基因组、转录组及表观遗传组的差异, 为认识肿瘤发生、发展及转移的生物学机制提供全新的视角。例如, 2017年, Gao等对一位结肠癌患者的CTC、原发灶肿瘤细胞、转移淋巴结细胞进行了全基因组测序分析, 发现CTC拷贝数变异(CNV)存在较大的异质性, 揭示了可能只有部分肿瘤细胞可能形成转移灶。因此, 单细胞全基因组测序提供了从根源上分析原发灶、CTC、转移灶的遗传变异的手段, 揭示肿瘤转移机制的可能性。
其次, 单细胞转录组测序和表观遗传学分析技术也处于蓬勃发展的状态。单细胞转录组扩增技术的发展解决了单细胞转录组样品量少而难以检测的问题, 实现了对单细胞全转录组的测序。特别是以液滴微流控技术和编码技术为基础的Drop-seq和inDrop技术发展, 使得快速、便宜、高通量的单细胞RNA测序成为了可能。基于液滴微流控的商用高通量单细胞转录组平台已经广泛应用于细胞分型、干细胞增殖与分化、肿瘤异质性研究、脑/神经系统发育、免疫异常研究等领域。随着CTC富集技术的发展, 高通量单细胞转录组测序技术必将在CTC领域发挥不可替代的作用。
张惠敏, 吴玲玲, 林冰倩, 王奕迪, 毕云鹏, 王炜, 宋彦龄, 杨朝勇. 基于微流控技术的循环肿瘤细胞分析研究进展. 中国科学：化学, 2019
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