液滴微流控芯片系统中微液滴特性表征及氨基酸检
微生物是工业生物技术的核心与基础。利用先进的现代自动化和仪器分析技术开发的高通量筛选平台，具有自动化、标准化、高通量化等特征，大大突破了人工筛选在速度、效率和标准化等方面的限制，是微生物菌种筛选的一次技术革命。然而，已经投入使用的各类高通量筛选系统主要是由国外公司开发的价值昂贵、操作复杂的大型装备系统，其普适性受到较大的限制。因此，开发操作简单、成本相对不高的高通量筛选系统是重要的发展方向，特别是近年来基于微流控芯片的检测和筛选系统更是受到极大的关注。
微流控芯片系统(Microfluidics)或微流控芯片实验室，是将化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选和裂解等基本操作单元集成到几个平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，由可控流体贯穿整个系统。目前的微流控芯片系统主要包括连续微流体系统和液滴微流体系统。基于连续微流体的微流控芯片系统研究较多，已经成功应用在蛋白和核酸的电泳分析上，并有商品化的分析仪。相对于连续微流体系统，基于液滴微流体的微流控芯片系统最大的优势在于可以形成独立的单个微液滴反应器，可以据此对分析样品进行单独包埋并在相互分开、互不干扰的微液滴小室中进行检测分析，使得检测和筛选细胞或其胞外分泌产物成为可能。该系统具有速度快、通量高、成本低等显著特点，对开展定向进化改造工程用酶，研究外分泌胞外产物(代谢产物)等相关研究领域具有重要的推动作用。
由于微生物筛选实验通常需要较长的时间，所以对微流控芯片中的微液滴有更高的要求，如提高微液滴的稳定性，优化生物兼容性以及防止微液滴内水相物质渗漏到油相等。本研究针对以上问题，以代谢产物(氨基酸)为研究对象，通过对包埋氨基酸的皮升级微液滴特性的研究，为液滴微流控芯片系统在氨基酸检测和相应生产菌株的高通量筛选以及定向进化改造方面奠定了基础。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
含有pET30a-mCherry的大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)菌株来由实验室保存，该菌株可以诱导表达产生荧光蛋白mCherry，用于检测微液滴的生物活性兼容性。
1.1.2 仪器与芯片
532nm激光器购自长春新产业光电技术有限公司；聚焦物镜购自奥林巴斯公司；Nikon1J1高速摄像机购自Nikon公司；532nm、610nm滤光片均购自北京卓立汉光仪器有限公司；光电倍增管购自CenturianSurplus公司；PCI6070e数据采集卡购自NationalInstruments公司；MODEL609E-6高压放大器购自Trek公司；Mitos压力泵购自环球分析测试仪器有限公司；硅片购自上海齐鸣硅材料有限公司；SU-8 2025光胶购自美国MicroChem公司；等离子清洗机购自美国Harrick公司；匀胶机购自中国科学院微电子研究所；加热台购自谊华电子设备有限公司；紫外光刻机购自中国科学院光电技术研究所；微流控芯片为自制PDMS芯片，PDMS购自Momentive公司。
1.1.3 主要试剂
AbilEM90购自EvonikDegussa公司；矿物油、钙黄绿素、Span80、CuCl2、EDTANa2均购自国药集团化学试剂有限公司；各种氨基酸均购自Solarbio公司；IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)、氨基酸氧化酶和过氧化氢酶均购自Sigma公司；丙二醇甲醚醋酸酯购自阿法埃莎(天津)化学有限公司；异丙醇购自北京化工厂；荧光底物AmplexUltraRed购自Invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 液滴微流控芯片整合控制系统的搭建(光路设置、数据采集和控制系统)及工作流程
如图1所示，本液滴微流控芯片整合控制系统采用非聚焦光路。
图1液滴微流控芯片整合控制系统示意图
激光器发出波长为532nm，发射后的激光通过滤光片除去杂波，然后聚焦到微流控芯片的检测点。当包埋荧光物质的微液滴通过检测点时被激发产生荧光，荧光经聚焦物镜聚焦后到达分光镜。通过分光镜将一部分荧光传给高速摄像机，实时监控微液滴的流动情况；另一部分荧光则通过滤光片，由光电倍增管(PMT)接收并将荧光信号转化为电压信号后，由数据采集卡采集并由LabVIEW软件进行分析。高压放大器用于微液滴的偏转，当目标微液滴的检测信号超过分选设定阈值时，分析软件通过高压放大器和微流控芯片上的电极对微液滴施加偏转电压。由于介电电泳力的作用，目标微液滴将发生偏转，流至分选通道得到收集。
1.1.1 液滴微流控检测分选芯片制备和微液滴生成
微流控芯片通过模塑法制备。首先根据要求利用AutoCAD软件设计芯片图形(图2A)并获得相应的光刻掩模(掩模由深圳美精微光电股份有限公司制作)，然后通过光刻法将图形转移到芯片上。具体步骤是：首先选取洁净的硅片，放到等离子机清洗4min，然后用匀胶机以1800r/min的转速均匀的覆盖一层50μm的SU-82025光胶，并在95℃下预烘30min；待其冷却后在光刻掩模下紫外曝光20s，在95℃烘40min；将未曝光的光胶用丙二醇甲醚醋酸酯和丙三醇交替冲洗干净，在110℃下加热30min，即获得所需芯片通道的阳模。芯片由目前被广泛采用的PDMS材料制作，PDMS具有较好的透气性、良好的透光性和生物兼容性[15-16]。将PDMS预制剂和交联剂以10：1的比例均匀混合后，倒在制备好的阳模上，在60℃下加热4h使其固化。揭下该含有微流通道的PDMS并与另一块平整的PDMS封合，即得所需芯片，芯片实物如图2B所示。微流控芯片以Mitos压力泵作为流体动力，利用PEEK材质的塑料管将其与芯片连接，采用流动聚焦(Flow-focusing)方式在芯片内生成微液滴。
图2微流控芯片设计示意图(A)及实物图(B)
1.2.3微液滴特性研究和氨基酸包埋检测分析
利用微流控芯片生成油包水(w/o)的微液滴，通过包埋含有pET30a-mCherry的E.coli细胞并检测不同时间点荧光蛋白的表达量，测定由不同表面活性剂组成的微液滴对细胞活性的影响作用。根据微液滴的形态学检测，对生成的微液滴的稳定性进行研究。参照Kendall等研究方法[19-20]对微液滴的分子扩散情况进行研究。
氨基酸的荧光检测采用双酶偶联法。以谷氨酸与荧光底物AmplexUltraRed反应后的混合体系作为水相，以添加非离子型表面活性剂的矿物油为油相，生成包埋氨基酸反应体系的皮升体积微液滴，并对微液滴进行在线的荧光检测和筛选。通过类似方法对苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也进行了检测。
2结果与分析
2.1微液滴的生成
如图3所示，利用流动聚焦(Flowfocusing)方式生成微液滴，通过改变油、水两相的流速可获得理想大小的微液滴。
实验结果显示，自行设计的芯片生成的微液滴具有良好的单分散性(微液滴间相互独立)和均一性，微液滴直径可控制在20?50?m范围内，生成速度每分钟600?1200个。
图3微液滴的生成
2.2微液滴的生物活性兼容性
油包水(w/o)微液滴作为微反应器用于细胞培育或者代谢产物的反应，都要求微液滴有较好的生物兼容性，因而油相组分，尤其是表面活性剂的选择非常重要[11]。相对于离子型表面活性剂，非离子型表面活性剂对细胞和蛋白不造成强静电作用力的损害，因此，具有更好的生物活性兼容性。本研究对目前使用较多的w/o非离子型表面活性剂Span80和AbilEM90进行了测定。实验中以分别添加3%(V/V)Span80和3%(V/V)AbilEM90的矿物油作为油相，对添加IPTG的E.coliBL21(DE3)(含有pET30a-mCherry)细胞培养液进行微液滴包埋，并对微液滴进行37℃静置培养。通过测定不同时间点微液滴的荧光值(Ex/Em:490nm/585nm)来反映微液滴内的细胞蛋白生物表达量。如图4所示，添加表面活性剂AbilEM90的矿物油包埋的E.coli细胞具有更高的荧光蛋白表达量，表面活性剂AbilEM90比Span80有更好的生物兼容性(图4)。故本实验最终选择含3%(V/V)AbilEM90的矿物油作为油相。
2.3微液滴的稳定性
微液滴需要在一定时间内保持稳定存在，从而为其检测筛选提供基础。因此，稳定性是微液滴的重要指标。本实验将谷氨酸等4种氨基酸分别进行微液滴包埋，对生成的微液滴在离线条件下室温培养，利用显微照相系统观察不同时间点微液滴的稳定状态。实验结果表明，微液滴室温培养20h后形态仍然保持稳定(图5)。对比培养前，98%的微液滴无融合和破裂，可以有效满足细胞产生相关荧光信号检测的要求。
图4表面活性剂对微液滴内细胞活性的影响
2.4微液滴的分子扩散
在培养过程中，如果微液滴内包埋的水相物质扩散到液滴外，并进入到另外一个微液滴内，必然影响检测和分选的效率，所以微液滴间低分子扩散与否非常重要。好的微液滴应该是包埋物质既没有渗透到微液滴外，也没有在液滴间发生交叉污染。扩散性是微液滴作为互不干扰的独立微反应器的重要指标。参照Kendall等人提出的方法对微液滴分子扩散情况进行了检验。
采用含3%(V/V)AbilEM90的矿物油作为油相，5mmol/L钙黄绿素、10mmol/LCuCl2、0.1mmol/L谷氨酸混合液作为水相1，乳化成的微液滴为E1；50mmol/LEDTANa2作为水相2，乳化成的微液滴为E2；水相1和水相2以体积比15混合作为水相3，乳化成的微液滴为E3；微液滴E1和微液滴E2以体积比15混合为微液滴ME，测定4种微液滴在不同时间点的荧光值(Ex/Em：490nm/515nm)。结果表明，室温培养20h后，微液滴ME的荧光值几乎没有变化，微液滴间的分子交换＜2%，对微液滴的检测和分选影响可以忽略(图6)。因此，选择含3%(V/V)AbilEM90的矿物油作为油相生成的微液滴内物质无明显的分子扩散，可作为微反应体系。
图5微液滴稳定性
2.5氨基酸包埋微液滴的检测与分选
在上述研究基础上，利用搭建的液滴微流控芯片系统对氨基酸进行了检测与分选。实验以两种浓度的谷氨酸(10?mol/L和20?mol/L)为检测对象，通过液滴包埋，在图2所示的芯片中生成含有两种谷氨酸浓度的微液滴，生成速度为每分钟600个。
图6微液滴间的分子交换
两种不同浓度氨基酸包埋微液滴的荧光检测信号如图7所示。其中，包埋20?mol/L谷氨酸的微液滴荧光值高于设定的阀值，软件自动给出信号到高压放大器，产生偏转电压使微液滴受介电力作用偏转至“SORT”孔道，微液滴被分选，而包埋10?mol/L谷氨酸的微液滴不会被分选，流向“WST”孔道。实验结果表明，本研究设计的液滴微流控芯片系统具有氨基酸检测与分选功能，检测分选通量可达到每分钟600个。
图7谷氨酸微液滴的荧光检测与分选
3总结
液滴微流控芯片的优势在于可以形成相互独立无干扰的单个微液滴反应器，如果将每一个微液滴看成一个微反应器或者细胞培养器进行高通量的检测与分选，将为研究外分泌胞外产物(代谢产物)及其工程菌株的定向进化提供强有力的筛选平台。
本研究搭建的液滴微流控芯片高通量筛选平台具有设计简单、操作方便等特点。利用该平台进行了包埋氨基酸的微液滴的生成、微液滴特性研究和荧光检测与分选实验。实验结果表明：1)生成的微液滴直径可控，大小均一、稳定，微液滴内反应体系小，可节省大量试剂；2)微液滴可以长时间稳定存在，满足试剂反应或细胞培养对时间的要求；3)微液滴的包埋物在测试微液滴中稳定存在，微液滴间无交叉污染，不会对后期微液滴的荧光检测和分选产生影响；4)微液滴的筛选通量可达每分钟600个。这些实验为酶及氨基酸等细胞分泌物的检测分析和相应生产菌株的筛选提供了高通量筛选的可能，对液滴微流控芯片在定向进化方面的应用奠定了基础。
文献链接：
DOI: 10.13345/j.cjb.130361
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