3D细胞培养：市场和工业需求

所有的活组织都是由细胞组成的。为了研究细胞，科学家们将它们从原始组织中分离出来，并在受控和人造的环境中培育它们：这就是所谓的细胞培养。它于1907年首次使用，并在生物医学实验室中无处不在。细胞研究已经从在2D表面上进行演变为3D配置，以更接近地模拟人体内自然的3D栖息地：这就是我们所说的3D细胞培养。

图1  细胞疗法或再生医学

1.三维细胞培养的目的

细胞疗法或再生医学，它包括生长在患者体内的细胞以修复受损组织。该领域包括几个研究领域，如图1所示。

用于药物发现的3D 体外模型，其目的在于创建模拟活组织的3D细胞模型，以使大部分研究和药物发现可以在体外而不是在动物（或人类）上完成。如图2所示，3D体外模型旨在用于临床试验之前药物发现的不同阶段。

需要指出的是，细胞培养的另一个基本目标通常是使用细胞产生病毒或抗体。然而，传统上这是通过二维细胞培养实现的，除了提高产量外，没有什么需要向真正的三维细胞培养转变。

图2 用于药物发现的3D 体外模型

Allied Market的研究估计，截至2015年，全球3D细胞市场为7.65亿美元，预计2022年将增长30％至469.9亿美元 [4]。他们将市场分为四类：药物发现，癌症研究，再生医学和干细胞研究。根据我们更广泛的分类，我们认为干细胞研究的一部分与再生医学一起参与细胞治疗。这是因为干细胞可以在体外分化成所需的细胞类型并被重新植入以修复组织。另一方面，我们认为，虽然癌症和干细胞研究是他们自己的主要参与者，但他们在开发3D体外模型方面发挥了重要作用。因此，我们发现大部分市场有助于药物发现的3D体外建模（图3）。这在很大程度上是由于癌症研究的一个重大推动，而癌症研究本身就是世界范围内癌症发病率上升。

2.三维细胞培养的种类

微芯片、生物反应器、水凝胶等。

3.谁对3D细胞培养感兴趣？

从地理位置上看，Allied Market Research估计2015年美国是三维细胞市场中最大的演员，占市场的41％，而欧洲占29％，亚太占19％，巴西，南非和沙特阿拉伯占11％（图5）。2022年，他们估计美国和欧洲在市场上的重要性之间的差距将会减小，美国的贡献率为35.3％，其次是欧洲的31.5％。

  三种主要类型的终端用户参与3D细胞培养市场：生物技术和制药公司，学术实验室和合作研究实验室。

4.为什么要多加一个第三维？

答案很简单：因为在正常的环境中，细胞在三维空间中演化！现在确定细胞在3D中的表现与2D相比有很大不同。当3D中的细胞显示出与2D中的细胞不同的反应时，这证明3D培养细胞用于药物测试至关重要。

简而言之，在3D中培养细胞允许细胞采用类似于体内发现的形态学和迁移模式。重新形成细胞的正常形态是重要的，因为它们的形状可以直接影响它们的生物活性[8]。由于细胞迁移是许多疾病（如癌症）中的一个中心过程，可以以药理学为靶点，因此在体外忠实地复制迁移模式也很重要。一般来说，将细胞放置在3D中有效地增加了它们与其周围环境的相互作用程度。它迫使它们在整个表面区域与它们的微环境（无论是支架，水凝胶还是其他细胞）进行更大程度的相互作用，就像它们在组织中所做的那样。这是至关重要的，因为现在已知细胞与其ECM和微环境的相互作用对许多细胞功能是必不可少的[7-9]。另外，3D支持系统提供物理和生物化学锚定，可以被设计为在体内复制条件。构成细胞外基质的刚度，孔径或配体可以被微调以模拟感兴趣的组织。最后，3D细胞培养允许形成和研究更复杂的多细胞结构，例如球体，类器官或微血管。

5.用于药物发现的3D体外模型

问题：药物发现过程中真正的瓶颈

发现了一种在实验室中成功治疗疾病的药物！这是一个里程碑。这通常意味着你已经在小鼠身上研究了药物。现在，您需要决定是否要花费大量的时间和金钱来通过严格的法规和更多的临床前测试，直到您的药物可以在人体临床试验中进行测试。只有发现......什么也不做，更糟的是，无法预料的副作用。

这是目前药物发现过程的悲伤现实：在小鼠中使用的10种药物中约有9种不在人体中 （图7）。这些统计数据表明，问题很可能在于临床前模型的预测能力：我们需要更好地重述人类对药物反应的模型。特别是认为主要问题在于未能预测药物的疗效及其毒性。这是目前制药行业面临的巨大瓶颈。想象一下平均10年的花费和26亿美元的无花果。仍然想知道为什么我们目前还没有轻易治愈所有重大疾病？

我们需要重新考虑药物发现系统，以便更有选择性地过滤最终对人类起作用的药物。其目的提高药物发现过程的成功率，提高产量并降低相关成本。

不用说，新的试剂不能直接在人体上测试，事先没有证据证明其潜在的毒性。相反，科学家传统上一直使用替代模型来预测药物在人类中的作用，例如动物或细胞模型，各有利弊（图8）。请注意，图8中列出的大多数优点和缺点适用于整个体外模型，即2D和3D蜂窝系统。

利用动物模型的主要优势是无与伦比的。这意味着不仅可以评估药物对细胞的局部影响（就像您在典型的简单细胞研究中那样），还可以评估其对整个身体（换句话说，对于多个器官）的系统影响。同样，现在越来越明显，细胞的微环境不仅影响细胞的生理机制，而且影响它们对药物的反应[42]：因此，能够研究药物在动物中的作用是有利的，细胞类型正在实时交互。

虽然众多强大的老鼠模型已经被描述，但它们的一些内在限制将难以克服。例如，动物的结果固有地基于非人类细胞和病原体，其可能不能完全地模拟人类药理学反应。虽然研究已将人类细胞引入小鼠，但通常必须在免疫系统受损的小鼠中进行以防止人类细胞排斥。这反过来意味着动物模型不能正确反映免疫细胞的作用，应该考虑到这一点，因为很明显免疫细胞是许多疾病的关键演员。在任何情况下，小鼠中引入的人类细胞都与鼠源的细胞微环境相互作用，这可能不能正确反映患者中发生的全人体细胞相互作用。相反，细胞研究可以完全由人类细胞组成。这避免了将动物结果外推到人体所造成的差异，这对免疫系统来说尤其明显。尽管细胞模型仍未能总是预测人类对药物的正确反应，但三维细胞培养领域仍处于起步阶段，并且正在迅速发展; 因此可能比动物模型更适合填补临床前预测模型中的当前缺口。事实上，许多新兴的3D细胞培养产品已经在药物发现过程中实施。传统上，三维器官芯片已广泛用于学术环境中的疾病建模。他们现在也正在转向更多的药理学应用，如药物筛选，毒性和药代动力学检测。3D细胞培养也可以大大推进细胞治疗领域。

6.细胞疗法

细胞疗法的目标是替换患者损伤或衰竭器官的组织。为了实现这一目标，在进行基础体外研究和开发用于使细胞最终植入患者体内的方案方面作出了巨大努力，使用各种3D细胞培养产品。

支架装载细胞并最终植入患者体内以局部再生目标组织。

三维支架可放置在生物反应器内以促进三维细胞的研究，优化组织生长并预测植入物在植入后的机械响应。这在生物反应器中得到了独特的促进，因为它们能够对培养环境提供如此严格的控制，并且能够对组织进行物理调节，以模拟细胞在移植后会发生的作用力[2]。传感器通常集成在生物反应器中，这有助于建立计算模型并获得精确的实验数据，以预测细胞对其植入体内的反应。

可以向患者注射   干细胞以促进组织特异性再生。有趣的是，已经表明与3D中的培养相比，3D中的生长干细胞具有临床益处。例如，在3D中扩展球体中的间充质干细胞增强了它们在小鼠移植后的抗炎反应[15]。干细胞的球体也被用于提高临床试验中干细胞生产的产量。

类固醇是由干细胞或器官祖细胞体外发育而来的，它们自我组织成类似于器官的基本显微解剖结构[16]。因此，人们认为他们有朝一日可以成为替代某些器官的移植来源。到今天为止，复制肾脏或冒号的类器官已经移植到小鼠身上，并且长期植入成功。

可以使用3D打印器官进行移植，而不是使用自组装的类器官。虽然我们远不能印刷整个器官的精确复制品，但已经成功地植入动物和人体中的膀胱，气管，骨和软骨的生物印刷品[17]。

最后，虽然微流体芯片往往与建立3D体外模型更相关，但是一些微流体工具已经被开发用于将细胞包封在3D ECM中，其可以植入患者体内。一项研究使用微流体装置来制造水凝胶微纤维，然后将其用于在小鼠中包封和植入胰岛。

7.微流控

微流控技术依赖于使用10-100微米高度或宽度的小通道来处理小体积流体。它们与传统的3D细胞模型的关键特点是它们能够更好地控制细胞，物理和生物化学微环境。这使得研究人员能够模仿更全面的人体组织的复杂细胞模型[23]。

微流控芯片的设计可以由许多不同的通道或隔室组成，可以很容易地满足研究人员的需求。这种区室化允许在生理长度尺度上对细胞分布进行独特的空间控制，特别是对于不同细胞类型的共培养。现在许多微芯片已经将电子和机械致动器（例如阀门或开关）集成到微芯片上，从而有助于在同一芯片上实现多个连续步骤。这个概念通常被称为芯片实验室（lab-on-a-chip）：许多耗时的实验室任务可以微型化并自动化集成到微流控芯片上。与传统的宏观测定相比，这种小型化还减少了所需的试剂和细胞的消耗，这降低了成本。

通道的存在允许在尺度上控制流量。这有助于跨越通道形成化学或物理梯度（例如细胞因子梯度或间质压力），这在许多生物过程中是重要的。

微流控芯片中的细胞与显微镜物镜之间的短距离能够以比其他传统宏观体外系统更高的分辨率成像整个样品。

微芯片 存在一些重要的限制：主要的是如果需要进行后续测试，则细胞难以检索。另外，即使它们被检索到，大小也可能不足以用于后续测试。然而这些挑战正在逐渐在克服，以适应3D细胞培养市场的需求。

8.显微镜下3D细胞培养的未来

为了跟上药物发现和细胞治疗市场日益增长的需求，3D细胞培养面临着许多挑战。

第一个是可重复性：通常，3D细胞培养结果太可变。这种可变性的来源是三个方面。第一个是生物。众所周知，细胞和细胞衍生的产物（如Matrigel或血清）在不同批次的生产中是不同的。第二个变异来源是基于用户的：与3D细胞培养相关的许多程序如移液是手动完成的，因此容易受到用户依赖性的变化影响。最后，很多方案可能受环境因素的影响，这些环境因素在测定中通常不受局部控制，例如温度或湿度，这些因素可能会非常影响关键步骤，如3D凝胶聚合。同时，3D细胞培养程序远非易事。他们需要专业和训练有素的工作人员长。另外，这些任务耗时且成本高昂。

这些问题都指向了3D细胞培养领域的两大需求：自动化和标准化。理想情况下，需要新产品来促进这些三维细胞培养过程，并减少人为干预，以最大限度地减少人为错误，加快并提高吞吐量和再现性。目前，细胞传代或细胞扩增等任务的自动化正在进行中[2]。

3D细胞培养领域的另一个主要瓶颈是缺乏简单的读数。太多的研究都严重依赖3D成像来分析细胞形态，迁移或生存能力。这需要大量的时间，并需要使用昂贵的专用设备，如共聚焦显微镜。同时，还需要努力使分析方法标准化为了量化这些结果：重建3D图像远非易事。虽然有几种3D重建软件包可以在商业上获得，但仍然很难定义，提取和量化来自这些复杂数据集的新变量。

微流控技术已经显示出自动化和简化繁琐程序的巨大潜力。例如，一些微流控芯片具有自动化的ELISA方法[28]，并且将质谱结合到微流控芯片上。这最大限度地降低了成本和时间，但也有助于通过最大限度地减少人为干预来标准化结果 然而，朝着3D中细胞的操纵方向发展可能会更困难。虽然在微流控工具中操作流体是常规操作，但操作和混合不同粘度的溶液（如细胞悬浮液和3D水凝胶）更具挑战性，因为它需要克服层流。

团队还发现了将微流体芯片与简单读数相结合的方法。例如，Whitesides小组开发了比色纸基微流控技术，这样检测结果只是通过颜色变化显示[29]。微流体芯片还具有促进个性化医疗的明显优势。

与此同时，努力开发具有受控环境的微流控芯片，就像生物反应器一样。例如，重新创建缺氧环境的微流体工具已经被创造出来以模拟癌组织中的缺氧[30]。在另一项研究中，将微流控芯片连接到压力控制器上，以便在细胞上施加周期性的压力和变化，就像在肺部经历的那样[31]。换句话说，微流控芯片可以成为他们自己的微生物反应器，从而获得生物反应器为3D细胞培养提供的许多益处。同时，集成传感器的微流体正在开发中[32]，并且很可能在不久的将来变得更加普及。传感器的存在与生物反应器非常相似，可以监测重要变量并有助于实现自动化和可追溯性。

微流体技术实现的自动化，小型化和高精度也将有助于标准化的程序，如细胞分化。事实上，需要分化的细胞如干细胞或单核细胞通常使用常规的宏观体外方案进行分化，如果不控制化学和环境刺激，则可能容易产生大的变异。相反，微流控芯片可以精确控制培养基中营养物质的输送，或氧浓度或流体特性，所有这些都可以影响干细胞的分化[33]。与此同时，这些芯片与蛋白质分析等传感器的结合使得细胞分化过程中特定线索和信号通路的作用得以解开[34]。

由微流体促成的小型化和自动化提供了从科学中心向更其他方面的繁琐程序的最终可能性。这已经用于测试肝功能的微流体[35]。相反，3D细胞培养的微流体应用目前需要许多步骤，只能在实验室进行。然而，随着研发进展，3D细胞培养微流体技术也可能成为即时诊断方法，如果在偏远地区，直接在诊所中使用也不是不可能。

独特的微流控芯片可以使血管结构灌注。简言之，当内皮细胞在适当的3D凝胶（例如纤维蛋白）中混合时，它们形成血管。虽然这可以以任何形式发生，但微流控芯片中的容器形成直接连接到微流体通道的开口[36]，[37]。这意味着可以通过微流体通道直接进入血管的血管内隔室，使得血管可以被颗粒，细胞或培养基灌注。这对于重新创造许多涉及脉管系统内细胞或分子运输的生物学过程或仅仅是为了能够在脉管系统内灌注药物至关重要，因为它们将在患者中递送。另一方面，类器官也可以在微流体芯片中生长以更好地控制其发展。那是，微流体隔室会限制并因此在一定程度上控制器官形状和尺寸。最终，可以将类器官与微流体芯片内的血管网络混合以获得可灌注的器官型模型，并实现更复杂的组织模型。最终，将干细胞/类固醇结合到微流控芯片中意味着能够使用患者衍生细胞创建个性化的细胞模型[27]。

与此同时，微流控系统在免疫细胞研究中具有独特的优势，正如其他地方广泛审查的一样[23]。这是因为它们允许建立细胞因子梯度，这对免疫细胞是重要的指导线索。微流体模型提供的流量控制对于在血液循环中重建免疫细胞运输至关重要。沿着同样的路线，先前讨论的在微流控芯片上灌注血管的能力对于在血管内和血管内再生免疫细胞运输也是独一无二的，就像它们在体内一样。最后，免疫细胞是高度移动的和异质细胞，必须经常将其视觉化以作为研究它们的手段。微芯片极大地促进了它们的高分辨率成像以进行详细分析。

最后，微芯片一直是器官芯片的唯一技术努力[25]。正如我们之前所讨论的，由微芯片提供的对微环境的增强控制使得该技术对于开发器官型模型而言是独特的。另外，促进流动使得器官之间的连接和相互作用能够使分子从一个器官转移到另一个器官。这些相互作用已被证明是药物测试的关键。例如，肠道和肝脏已经在芯片上结合，因为药物首先通过肠道吸收，然后通过肝脏代谢[38]。他们的组合已被证明影响药物的命运不同于胆汁肝脏分别培养的芯片[39]。在胃内加入胃还可能对模拟胃排空很重要，所有这些都会影响药物的药代动力学[40]。

最近，研究人员首次在3D芯片上进行了生物打印 -心脏芯片：这对促进和标准化芯片制造器件显示出巨大的希望。此外，柔性传感器被集成在组织的微架构中。

总而言之，我们相信微流体技术为3D细胞培养领域提供了很多可能，如果努力将其潜力从学术环境转化为临床方面。然而，所有这些都需要工程师，生物学家，临床医师，健康监管人员之间的合作和努力......