Sci. Adv.：缺陷诱导增强酶-金属有机框架复合物的活性

酶在细胞中具有高催化效率，但是在与细胞环境不相同的条件下，酶的寿命会缩短并且催化效率降低。解决这一问题的方法之一是设计一种仿生微环境来保护酶，从而使其功能可以保留在不利的环境中。由金属离子和有机配体形成的金属有机骨架（MOF）具有多孔结构以及平衡的刚性和柔性，这类似于细胞环境。研究人员已开发出多种方法将天然酶封装在MOF中构建仿生微环境，从而改善酶在恶劣环境下的生理功能。其中，共沉淀和仿生矿化是在环境条件下将酶、金属离子和有机配体在溶液中混合，以制备酶-MOF复合物。然而，共沉淀方法合成的酶-MOF复合物的活性与细胞环境中酶的活性相差甚远。为了提高酶的活性，迫切需要研究在共沉淀过程中酶、金属离子和有机配体的作用机制。

图1 基于微流体通道内层流梯度混合产生的晶体缺陷效应提高酶催化剂表观活性示意图。在微通道中，由于反应物浓度梯度变化产生配位缺陷，生成含有介孔的酶-MOF复合物（A），而在常规溶液反应下形成的酶-MOF复合物为微孔结构（B）。

微流体技术以小规模（微米）处理流体，不仅实现了按比例定律可预测的效果，而且还实现了新的流体力学特性。这些特征允许在空间和时间上对液体进行精确处理，以获得在本体合成中不可能的混合条件。近期，香港浸会大学任康宁博士和清华大学戈钧副教授合作提出了在微流体流中合成酶-MOF复合物，其中酶活性显着提高。作者在微流体系统内部使用了三元混合方案，实现了精确控制的扩散混合条件，并允许一种成分在几秒钟后加入系统。微流体合成中MOF前体的浓度不断变化，导致酶-MOF复合物出现结构缺陷，从而提高了底物的亲和性和酶活性。相关成果以“Defect-induced activity enhancement of enzyme-encapsulated metal-organic frameworks revealed in microfluidic gradient mixing synthesis”为题发表在Sci. Adv. 上（DOI: 10.1126/sciadv.aax5785）。

作者首先使用双Y形微流体在微通道中合成酶-MOF复合物，锌离子（Zn2+）、2-甲基咪唑（2-MeIM）和蛋白质作为反应物，第二个Y形微流体用于在前两种反应物混合后再添加另一种反应物。反应物之间的混合依赖于流体扩散，由于雷诺系数低，这是一种可精确预测的合成方式。该方法可以通过时间间隔转换来控制混合，计算微通道中的速度分布和浓度分布，反应物经过足够的时间混合后再到达在第二个Y结处与蛋白质分子混合。在该微通道中，作者以三种代表性的混合方式合成了细胞色素c（Cyt c）-MOF复合物，验证了蛋白质-MOF复合物形成的可能机制，表明蛋白质分子首先吸附2-MeIM，然后诱导蛋白质周围MOF骨架的仿生矿化。微流体制备的酶-MOF复合物的结晶度降低，XRD峰向低角度移动，这可能是由于复合材料中的缺陷所致。

为了研究微流体合成中的特殊混合方式是否会改变产物的性能，作者使用微流体流制备了葡萄糖氧化酶（GOx）-MOF复合物，其负载了8.45％的GOx，并显示出98％的GOx活性，这是通过共沉淀过程制备的酶-MOF复合物的酶活性的最高记录。为了验证酶-MOF复合物具有高活性是否是由于2-MeIM和Zn2+之间相对较高的摩尔比，作者通过调节2-MeIM和Zn2+的比率合成了GOx-MOF复合物。梯度混合诱导的酶-MOF复合物具有高催化活性，其中比率的连续变化是关键因素，而不是高比率。为了研究梯度混合法使酶-MOF复合物的活性显着增加的根本原因，作者采用微流体流动合成和本体溶液合成制备了GOx-MOF复合物。通过傅立叶变换获得了R空间信息研究微流体合成样品与本体溶液合成的样品中的Zn原子周围的短程局部结构，结果与锌和N原子的配位相对应的峰有良好的一致性，这表明Zn-N配位也存在于微流体合成MOF中。相比本体溶液合成MOF，微流体合成MOF中锌原子具有较高的表观配位数，揭示了在微流体合成的GOx-MOF复合物中，锌原子出现在骨架中并与N原子相互作用导致了锌原子配位缺陷。

微流体合成Cyt c-MOF复合物的、结构、形貌等示意图（来源：Sci. Adv.）

为了验证该方法的通用性，作者使用辣根过氧化物酶制备了HRP-MOF复合物。与天然HRP相比，HRP-MOF复合物中HRP负载量百分比为4.71％，并且具有约63％的活性。酶活性增强的原因可能是酶分子在MOF纳米晶体的生长过程中被囊封，因此靠近颗粒表面，从而可以更好地接近底物分子。同时，微流体合成的酶-MOF复合物在高温和蛋白酶消化下的稳定性也优于相应的天然酶，并且作者还观察到增强的可重复使用性和存储稳定性。微流体合成复合材料活性的提高主要归因于MOF中的缺陷，从而促进了基质的扩散。与本体溶液合成相比，通过微流体合成制备的所有复合物均显示出显着增强的活性，但通过微流体以不同混合方案合成的复合物也显示出活性差异，这可能是由于酶在MOF中的位置不同所致。当使用微流体层流合成方法时，可以将缺陷的程度控制在合适的点。

微流体合成的酶-MOF复合物与单一酶活性的对比（来源：Sci. Adv.）

小结：香港浸会大学化学系任康宁博士和清华大学戈均副教授等人合作，通过微流体合成酶-MOF复合物，提高了酶的活性、稳定性和耐久性。在沿着微通道的反应物比率连续变化的情况下，所得产物显示出配位缺陷，形成中孔微结构。孔径的多峰分布确保了酶的固定，降低了对传质的抵抗力。微流体层流合成策略独特的梯度混合性质，可控制、连续和快速地合成具有改进活性的酶-MOF复合材料，这为酶-MOF复合材料和其他生物复合物的合成提供一种新的通用方法。