基于仿生多价核酸适体功能化微流控芯片的微小残留病检测新方法

免责声明：文章来源《杨朝勇课题组》微信公众号 编辑：面面 撰稿人：刘艺龙  以传播知识、有益学习和研究为宗旨。 转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除。

大家好！今天为大家介绍本课题组2020 年发表在Small上的文章，题目为 “Highly Sensitive Minimal Residual Disease Detection by Biomimetic Multivalent Aptamer Nanoclimber Functionalized Microfluidic Chip”。本工作受自然界中攀援植物的启发，构建了一种具有柔性骨架的多价核酸适体聚合物，结合“增频碰撞”的微流控芯片，提出了一种入侵性低、灵敏度高、临床适用性强的微小残留病检测新方法。论文的第一作者是本课题组三年级博士生刘艺龙同学（课题组网页：http://www.yang-lab.com/）。

【背景】
        微小残留病（Minimal residual disease, MRD）是指治疗过程中或完全缓解后存在于白血病患者体内的少数白血病细胞，是白血病复发的主要原因。精准的MRD检测结果可用于评估患者对初始治疗的反应，进而按照危险度进行分层治疗，还可用于评估造血干细胞移植后的疾病负荷变化以及预测白血病早期复发等。然而，传统的MRD检测技术面临灵敏度较低或者临床适用性较差的问题。例如，对于急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）来说，基于流式细胞术的免疫表型分析临床适用性好（适用于超过90%的患者），但其灵敏度仅为~10^-4（在10⁴个背景细胞中检测出1个白血病细胞），因此需要高入侵性的骨髓穿刺进行取样；相反，基于RT-qPCR的遗传学检测的灵敏度高至10^-6，但其仅适用于不到20%的表达常见融合基因的T-ALL患者。因此，发展一种入侵性低，灵敏度高，临床适用性强的MRD检测新技术具有重要临床意义。 

        微流控技术具有容易集成，高通量和高灵敏度等优势，特别适用于外周血中微小残留病细胞的富集和检测。其中，相比于物理分离方法，结合特异性识别分子的亲和捕获方法具有靶细胞捕获率和纯度高的优点。核酸适体被誉为“化学抗体”，在癌细胞识别与捕获方面具有许多优于抗体的特点，例如价格低廉、批次间差异小、容易修饰和组装等，最重要的是能够通过互补DNA置换或者核酸酶降解等方法实现癌细胞的无损释放，为癌细胞的下游分析提供前提。但是，核酸适体的空间结构易受复杂环境的影响，从而影响其亲和力，阻碍其临床应用。因此，设计高稳定性和高亲和力的核酸适体探针是解决上述难点的关键。

【设计思路】

自然界中的攀援植物具有灵活的骨架，能够帮助它们适应不同的地势，而骨架上众多的吸盘或卷须结构，能帮助它们牢牢地攀附在支撑物上面。受此启发，作者通过简单的自由基聚合反应合成了具有柔性骨架的多价核酸适体聚合物（MANC），长而灵活的骨架可适应细胞的表面拓扑学结构，且骨架上的众多核酸适体能与白血病细胞上的多个受体结合，这种协同的“多价识别”效应能够显著提升核酸适体对靶细胞的亲和力。同时，作者利用了课题组前期为了提高循环肿瘤细胞的捕获效率而设计的具有“增频碰撞”作用的微流控芯片，进一步增加白血病细胞与MANC的碰撞频率。该芯片内按照确定性侧向位移原理排布了上万个旋转的三角形微柱，血样流过芯片时，尺寸较大的白血病细胞能够发生侧向偏移，反复与微柱上的MANC碰撞，从而提高捕获率；而尺寸较小的血细胞则沿着原本的流线向前运动，与微柱碰撞表面的MANC碰撞概率低，从而减小背景细胞的非特异性吸附。最后，作者选用核酸酶处理以选择性地释放被捕获的白血病细胞，为白血病细胞下游分析提供了前提（图1）。

图1 （A）仿生多价核酸适体聚合物的合成；（B）协同尺寸分离和多价识别的白血病细胞亲合捕获及选择性释放的微流控平台
【数据介绍】作者在系统地优化完聚合反应条件后，通过琼脂糖凝胶电泳实验证明了该反应具有很高的重现性；通过假设1）所有反应单体的反应活性相等；2）聚合物和DNA marker具有相同的电泳迁移率，得出聚合物上的平均核酸适体数量为~30条（图2A）。同时，考察了40%（v/v）人血清条件下单价核酸适体和多价核酸适体聚合物与靶标细胞的平衡解离常数。如图2B-C所示，单价核酸适体的Kd值为59 ± 9 nM，而多价核酸适体的Kd值下降至1.03± 0.14 nM，仍具有非常高的亲和力。

图2 多价核酸适体聚合物的表征。（A）聚合产物分子量及聚合反应重现性表征；（B-C）单价核酸适体（C）和多价核酸适体（D）对靶细胞的平衡解离常数表征

        通过生物素和链霉亲和素之间的强相互作用，制备了多价核酸适体聚合物功能化的微流控芯片（MANC-Chip）。为了证明MANC-Chip提高了细胞捕获性能，作者对比了全血条件下MANC-Chip、单价核酸适体修饰功能化的芯片（Sgc8-Chip）、嫁接随机DNA序列的聚丙烯酰胺功能化的芯片（nMANC-Chip）的白血病细胞回收率（图3A）。通过回归方程的斜率计算捕获效率，MANC-Chip的白血病细胞捕获率高达92.2%，相比Sgc8-Chip提高了2.45倍，而非特异吸附率仅为0.11%（图3B）。作者接着考察了芯片的细胞释放性能。如图3C-D所示，88.9%的靶标细胞在核酸酶处理后能被选择性的释放，而吸附的正常白细胞几乎不会从芯片上脱落，这进一步提高了靶细胞的纯度，且核酸酶释放后，细胞活性仍有93.8%，为进一步的培养和分析提供了前提（图3E-F）。

图3 芯片的细胞捕获和释放性能表征。（A）回收率；（B）捕获率；（C）核酸酶介导的白血病细胞释放；（D）MANC-Chip的细胞释放率；（E-F）细胞释放后的活性表征

最后，作者将MANC-Chip应用于捕获临床T-ALL患者外周血样本中的残留白血病细胞，如图4A所示，同时表达T细胞抗原（CD3）和酪氨酸激酶7（PTK7）的细胞被认定为残留T淋巴白血病细胞，而CD3阳性且PTK7阴性的细胞为正常T淋巴细胞。如图4B所示，治愈的白血病患者（CR）外周血中的残留白血病细胞数量恢复到健康对照组（HD）的浓度水平；而部分缓解的患者外周血中的残留白血病细胞数量显著高于健康对照组（p = 0.0097）。说明MANC-Chip可用于区分部分缓解和完全治愈的T-ALL患者。值得一提的是，作者在一例流式检测阴性的患者中检测到30个残留白血病细胞，随后临床表现证实该患者疾病复发，患有中枢神经系统白血病。说明MANC-Chip能在疾病复发的早期检测到异常数量的白血病细胞。

图4 MANC-Chip在临床样本中的应用。（A）免疫荧光分析；（B）临床样本中残留白血病细胞数量统计图
【总结】
        本工作合成了一种仿生的多价核酸适体聚合物，显著提高了核酸适体在复杂体系中的亲和力。结合“增频碰撞”微流控芯片，进一步发展了一种低入侵性（外周血取样），高灵敏度（可达10^-6），高临床适用性（10/10）的微小残留病检测新方法。由于其高效的细胞捕获性能，MANC-Chip为白血病治疗效果评估，复发监测等提供了一种无创性的替代检测方法。此外，高效温和的靶标细胞释放性能为白血病细胞下游分析提供可能性，从而帮助我们更好地研究白血病的复发机制等。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/smll.202000949