影响PCR扩增的因素

       引物：在Tris缓冲液中，引物可以低温保存相当长的时间。除非有核酸酶的污染，引物一般非常稳定。笔者使用过10 年前的引物，仍然好用。问题的关键在于您的引物设计是否合理，使用过程是否规范。如果您怀疑引物有问题，可以选择重合。如果重合后，还没有改善，请查其他 原因。引物到用户手头前都是以干粉形式存在的，干粉很容易丢掉，引物溶解后可以测定一下OD，将所有引物的浓度调整到一致，对实验有一定帮助。

       高温聚合酶：高温聚合酶是非常稳定的，除非有蛋白酶的污染。但是不同公司提供的酶扩增是有差异的，活性定量和标示未必相同。选用表现一贯稳定的酶，而不是最便宜的。

       dNTP: dNTP是PCR扩增体系中最不稳定的，反复冻融会使dNTP发生降解。dNTP是由 dATP,dCTP,dGTP,dTTP等摩尔组成，但是他们的稳定性不同，发生降解的程度不同，导致4种dNTP的浓度不一致，即使不发生降解，4 种 dNTP如果浓度不等，PCR效率和正确率都会受到影响。建议分装小包装，减少反复动容冻融的次数。

       缓冲液：缓冲液一般不容易出问题，只是使用前需要彻底融化混匀使用。如果您PCR不熟悉，使用含Mg的缓冲液。缓冲液中可以加入适量的甘油、DMSO等增强剂，目的是改善高GC含量等疑难模板的扩增。

       Mg2+:是TAQ活性所必须的，浓度过高过低对反应都有比较大的影响。过低（<1mM），合成效率会下降，过高（>3mM），非特异性会加大。很多因素会使Mg2+的实际浓度受到影响，如TE中的EDTA, 反应用的dNTP等都会螯和Mg.

       温度：变性和退火温度是主要需要考虑的。变性温度过高（一般在90-94C），时间过长（一般45-60秒足够），酶的活性会受到影响，同时影响产率。对于退火温度，过低非特异性扩增增加，过高产率会下降。需要根据引物的长度，用途，组成确定退火温度和时间。

       模板：PCR 的关键之一，模板不是越多越好。可以通过倍比稀释来确定合适的浓度。纯度,不是最重要，但是不能有抑制Taq活性或螯和Mg 的试剂存在。模板的pH值接近中性为合适，否则会影响扩增体系的pH值。

      （转自：苏州汶昌芯片官网）