微流控SERS检测芯片及其生物传感应用
微流控芯片可将样品预处理、目标物分选以及检测等多个功能集成到一块芯片上，以流体和阵列多通道的形式缩短分析时间，为大规模高通量生物分析提供高效的实验和检测技术平台。微流控芯片具有高度的自由定制性及可操作性，若将SERS技术与微流控芯片技术结合，即可获得自动化的微流控SERS检测芯片。SERS效应的产生极度依赖于SERS增强基底。因此，微流控SERS检测芯片的一大关键是将SERS基底引入芯片中。根据芯片上SERS基底的类型可以将微流控SERS检测芯片(SERS-LoC)简单地分为三种：液态、固态及原位生长基底芯片。
液态基底是最早在微流控SERS检测芯片中使用的基底。这种基底的操作方法简单，并且可以直接利用微流中液体流动的特性进行散热，从而避免大功率激光对待测分子造成的光热损伤。最简单的方法是直接将制备好的金属纳米粒子通入微流通道内作为SERS检测的基底。如图 8(a)，将银胶通入微流通道内时，银胶与修饰拉曼分子的DNA连接，形成基底-拉曼分子结构，最终落在SERS检测区进行检测。液态的SERS基底最显著的优点是可以在微流芯片内流动，从而与拉曼分子充分混合。类似的还有图 8(b)中的研究，都是将制备好的金属纳米粒子通入微流通道。在微流控芯片内进行实验，其反应微环境相对可控，增加了实验的可靠性并能在一定程度上可以提高检测的灵敏度。此外，另一种液态基底利用微流控芯片良好的操控性，控制纳米粒子流动并让其聚集在理想的区域或者形成规则密集的聚集体。这些可控的纳米粒子聚集体可以提供大量的SERS热点，因而更有效地增强拉曼信号。目前，这种将流入芯片的纳米粒子捕获在一定区域，并控制纳米粒子的形貌、浓度等特征，使其形成纳米聚集体成为了液态基底的又一研究方向。如图 8(c)，在PDMS芯片上设置一个气阀，通过压力控制挤压其变形，从而阻止金纳米粒子通过而聚集在SERS检测区形成聚集体。在检测完毕后释放压力使芯片恢复，则金纳米粒子可以通过并被清洗掉。然而，这种基于阻塞流通的聚集体形成方法对纳米粒子的形貌要求较高，且形成速度较慢。图 8(d)给出了另一种可控纳米聚集体的形成方法。Hyundoo等人设计了三层的微流控平台：透明电极上的光导层、液体空腔及接地电极。当光导层被电磁激发时，电流通过光照区域在空腔内形成一个不均匀的电场，致使金属纳米粒子集中起来形成一个聚集体。并且通过改变光照区域可以在不同位置形成SERS基底。这一巧妙的设计可以很方便的将最简单的纳米粒子聚集在微流芯片上形成需要的聚集体作为基底使SERS信号得到极大增强。
图 8 (a) 集成DNA竞争取代序列检测的SERRS微流微系统。修饰DNA探针-报告分子对的二氧化硅微球(插图)充满一个区块。当目标序列引入到入口时，拉曼分子的链被取代。它们沿着通道流动时与金属纳米聚集体混合并被捕获在微流芯片中的SERRS检测区域。(b)A：基于SERS竞争吸附免疫检测的螺旋线双通道微流传感器示意图。传感器由两个平行的通道组成：一个检测PGA(浅灰)，另一个作对照(深灰)。B：注满四种不同颜色墨水的芯片图像。C：磁性免疫检测的捕获区域图。(c)用带气阀的通道捕获与释放金纳米粒子进行SERS检测的示意图。(d)光电微流SERS光谱。
小量样品的光电微流设备集成到一个传统的SERS检测系统。用一个激光光源可以同时达到使金属纳米粒子聚集和SERS信号的检测的目的在微流芯片内引入液态基底的方法简单方便，但液态基底的显著问题是液体的流动性导致基底形貌不均匀，进而使其产生的热点分布不均衡。后果是同一批次实验通道内不同位置的SERS信号强度差异较大，均一性不好。
虽然研究者提出了可重复性的基底作为改进，但能更好的解决这一问题的方案就是使用固态的SERS基底。近年来，由于制作工艺发展突飞猛进，许多应用在PDMS上的固态基底研究被报道出来。如图 9(a)，Young等人先用热蒸发法在PDMS上镀一层银，再用氧等离子处理后与玻璃键合形成微流通道。同时氧等离子体处理后可以在平展的银表面生成一些粗糙的微结构以增加热点而增强SERS信号。在这些精心设计的SERS基底中，一些3D等离子体的结构由于其大面积可吸附分析物的性质吸引了很多研究者的注意。如图 9(b)，在柱形硅阵列上溅射一层薄薄的银后形成一种被称为纳米柱森林(nanopillar forest)的基底结构被应用在微流芯片内。这一结构最突出的特点是其良好的可重复性，据报道在检测时相对误差只有13%。
图 9 (a) 光流控芯片的制做流程；(b)纳米柱森林的制造流程及其SEM图
此外，还有一类微流控芯片直接在微流芯片内部实现基底的制备并用于检测，被称作原位(in situ)生长的SERS基底。如图 10(a)，Xu B B等人用飞秒激光器引导光致还原，在通道内生成银微花形结构阵列，每一个单体的表面都非常粗糙，以此为基底可以产生很强的SERS增强效果。类似的，Yan W等人在微流内利用光化学还原银纳米聚集体，并发现在第一次光照还原生成纳米粒子后将其洗去接着第二次在相同的激光下再次生成大量细小的银纳米粒子，这一关键的步骤直接导致在通道内产生了大量的热点，而使得在检测SERS信号时可以增强一个数量级(图 10(b))。
图 10 (a) 在微流芯片内激光制造SMA的示意图；(b)A：微流芯片内三个模块示意图，分别用红、绿和蓝色方块表示注射、混合和光学检测功能区。B：光引导银纳米聚集体的形成过程及原位SERS检测。注射区的硝酸银、水、CV和柠檬酸钠溶液用不同颜色表示。
微流通道内的流动用白色箭头指示随着微流芯片内SERS基底制备技术的不断改进与优化，SERS信号的灵敏度、特异性和可重复性得到了进一步的改善。微流控芯片与SERS技术二者的协同作用使得SERS-微流芯片(SERS-LoC)的应用越来越广泛。
生物检测
SERS的特异性与无损特性使其非常适合生物医学方面的研究。再加上微流芯片的稳定性、灵活性与微量样品检测的特性，目前，SERS-LoC的生物检测应用取得了不少突出的进展。
与在溶液中类似的检测原理，在微流控芯片中也可以利用SERS光谱来进行生物标志物的检测。miRNA是一种控制基因表达的非编码RNA，参与了生物体的很多过程。Novara C等人在微流芯片上制作了两种SERS基底(图 11(a))，分别检测带拉曼标记的miRNA和无标记的miRNA[58]。抗原作为最重要的肿瘤标志物之一也被引入到SERS微流芯片中。
Gao R等人制作了液滴的微流系统(图 11(b))，将磁球作为捕获基底，同时加入待测物PSA和SERS探针后在微流内充分混合。最后用磁铁将反应生成的磁球-PSA-探针免疫复合物分离，通过检测通道内剩余探针的SERS信号来反映待测物的浓度。微流控芯片的一大优势是可以模拟体液流动环境，这给识别并收集体内的循环肿瘤细胞(CTC)提供了研究平台。Pallaoro Alessia等人在微流通道内注入肿瘤细胞与正常细胞的混合液并使其排成一列流动(图 11(c))，通过激光照射区域得到SERS信号并利用两种分析方法即主成分分析(PCA)和最小二乘法进行分析。除了直接对细胞进行识别和分析，检测细胞分泌物作为研究细胞间通信的基础也是生物检测分析的一大课题。我们也提出了一种SERS微流芯片内用于实时监测细胞间通信的方法(图 11(d))。该芯片结合了SERS光谱编码技术与蛋白质阵列的空间编码技术，将大量待测样品中蛋白质的种类和含量信息加载到基于SERS的三维码中，只需通过三维码的解码即可获取所有样品中各种蛋白质的含量信息，该检测平台具有信息量大、检测灵敏度高(～10 fg/mL)、响应速度快(30 min)、操作简便等优点。
图 11 (a) 在硅片上修饰银纳米粒子作为基底集成在微流芯片上，A：一步法，B：两步法检测miRNA；(b)基于SERS的液滴微流传感器免清洗的磁性免疫检测示意图。这种传感器由5个部分组成，功能如下：ⅰ液滴生成及试剂混合；ⅱ形成磁性免疫复合物；ⅲ磁铁分离免疫复合物；ⅳ含有上清的更大的液滴生成来进行SERS检测；ⅴ含有磁性免疫复合物的更小的液滴生成；(c)微流芯片构成及概念示意图。细胞预先标记肿瘤特异性与对照探针(后者两种细胞都有修饰)，再注入芯片中，流向中心汇集后通过拉曼激光照射；(d)微流芯片示意图：A：顶视图B：侧视图。这一设备有两层：液体流动层(黑线)和调节流动层连接的控制层(粉色和蓝色图案)。在侧视图中芯片由3个功能区域组成。区域Ⅰ：细胞培养池(癌细胞)；区域Ⅱ：抗体条码(不同通道内基底与抗体相匹配)；区域Ⅲ：细胞培养池(免疫细胞被基底上的抗体捕获)
离子检测
小分子或离子的检测要求检测方法具有优异的可靠性与灵敏度。SERS-LoC的一系列优秀的特性使其成为检测小分子或离子的非常有力的工具。
硫氰酸离子作为评价人体健康的重要标记分子广泛存在于体液中，检测体内硫氰酸离子的浓度对临床诊断与疾病预防很有意义。砷作为一种环境中普遍存在的污染物影响着人们的健康，图 12(a)中展示了一种间接检测砷离子的策略[64]。Nan等人将银纳米粒子修饰谷胱甘肽(GSH)和拉曼分子作为探针，在之字形微流通道内使砷离子与探针充分混合，其中砷离子与谷胱甘肽结合可以导致银粒子的聚集从而增强SERS信号。这种方法可以检测低至6.7×10-10g/mL的砷离子。我们设计了一种液滴SERS微流控系统，将样品与银壳金纳米棒混合形成液滴在通道内流动并进行快速的SERS检测(图 12(b))。这种方法在人血清中检测动态范围达到4到256 μM并可以实现真实唾液样本的检测。
图 12 (a) A：用来检测砷离子的微流芯片示意图。砷离子与GSH/4-MPY修饰的纳米粒子在之字形微流通道内快速、充分混合(插图)。B：砷离子的分析原理。当砷离子与GSH/4-MPY修饰的纳米粒子耦合时发生聚集，银纳米粒子上的4-MPY的拉曼信号被增强；(b)A：液滴微流设备的示意图。B：银壳金纳米棒的SERS光谱(红色)及加入硫氰酸离子后的SERS光谱(蓝色)
便携的SERS-LoC
利用高集成度的芯片可以在一块芯片上完成整个复杂的实验，使得微流芯片直接代替了实验室的环境，微小的尺寸使其有很好的便携性，可在任意地方进行实验。然而对于SERS而言，由于检测时需要光学校准和对焦等复杂过程，将SERS-LoC做成便携的设备成为不小的挑战。近来，光流控(optofluidic)的发展解决了这一困难[66]。如图 13(a)，Soroush等人将光纤元件集成到微流芯片上消除了SERS检测时光学对焦等负担[67]，使现场(on-site)SERS检测成为可能。除此之外，手持的拉曼光谱仪也可以用来实现SERS的现场分析[68]。图 13(b)显示了Kim等人提出的将芯片内的纳米柱阵列作为SERS基底，运用手掌大小的便携拉曼光谱仪进行在现场的SERS检测牛奶中的三聚氰胺[69]。这种简便的拉曼光谱仪并没有降低检测灵敏度，实验在水溶液中检测限达到1.2×10-10 g/mL，而在奶粉提取物中检测限为1.0×10-10 g/mL，均达到了FDA要求的标准。随着更多简易方便的平台被研究出来[70]，为现场SERS检测而准备的便携设备越来越成熟。
图 13 (a) A：光流控SERS微系统示意图。B：光流控SERS系统。C：充满的微球和集成的光纤；(b)牛奶中三聚氰胺检测的比较使用A：标准的FDA过程和B：我们的纳米柱检测方案。在显示金纳米柱芯片用于分子检测同时展示的具有代表性的SEM图为打开(左)和关闭(右)的金纳米柱五聚物分别对应处理过滤的牛奶前后
结束语
综上所述，本文简单介绍了SERS的原理，着重从基底的设计上叙述了SERS的发展。接下来总结了几种SERS在生物传感中的应用，主要从SERS探针的制备和不同待测物的检测两方面进行概述。通过将SERS基底引入到微流芯片内形成微流控SERS检测芯片(SERS-LoC)。在微流控SERS检测芯片中，无论是液态、固态还是原位生长的SERS基底都有其特点及应用背景。最后，我们讨论了目前微流控SERS检测芯片的几种应用。检测的分析物有DNA、抗原、生物标志物、细胞、汞离子、砷离子等。随着科学技术的发展SERS-LoC系统也逐渐趋于便携性，出现了手持的设备，为真正的on-site现场检测提供了有力帮助。
尽管微流控SERS检测芯片已经取得了引人注目的研究进展，然而检测特异性与可重复性、芯片的多功能化与集成度的提高等依旧是微流控SERS检测芯片今后的研究目标。尤其是如何直接使用实际临床生物样本进行目标物的检测。实际临床样品(如病人的血液)很复杂，它们往往含有丰富的蛋白质、DNA等。这些生物大分子在SERS检测的过程中都有可能提供非特异性的噪声信号，从而造成假阳性或假阴性的检测结果，严重影响检测结果的可靠性。
因此，对于实际样品来说，微流控SERS检测芯片的特异性问题尤为重要。通常，解决微流控SERS检测芯片的特异性问题可从两点出发。首先，优化SERS基底或探针的生物功能化修饰，提高基底或探针识别待测物的选择性和准确性；其次，在微流芯片内增加可对待测物进行筛选的功能单元，例如物理尺寸筛选或化学配体识别筛选，尽可能地排除其他物质的非特异性干扰。若微流控SERS检测芯片能够对实际的复杂生物样品进行高准确性地测试，则必将极大地推进微流控SERS检测芯片在临床诊断与治疗中的应用。此外，低成本的自动化微流控SERS检测芯片也是今后人们研究的重点目标之一。其关键是如何在保证完善的传感与分析功能的前提下，尽可能降低芯片的制作成本。低成本的微流控SERS芯片对于欠发达地区的生化检测(如疾病普查、环境监测等)具有非常重要的社会价值与现实意义。在将来，SERS与微流控芯片技术进一步发展，如将激光、光谱仪等设备集成到芯片上后会更大程度上发挥SERS-LoC的作用，为现场实时检测技术的完善作出巨大贡献，届时生命健康科学、生物医学等方面会极大受益。可以预见的是，随着功能的不断完善和性能的不断提高，集成的、自动化的SERS-LoC芯片必然会成为生物传感检测领域中一项非常重要的技术。
文献来源中国光学DOI: 10.3788/CO.20181103.0513
作者：王志乐, 王著元, 宗慎飞, 崔一平
（节选部分文章，转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）