单个肿瘤干细胞分离及其培养实验的方法

当前单细胞水平的研究越来越受到重视,已广泛应用于单细胞的PCR扩增、基因组测序和组织工程研究等领域。随着肿瘤干细胞研究的不断深入,单个肿瘤干细胞的有效分离和培养成为肿瘤干细胞发生的分子机制、侵袭和转移、肿瘤干细胞的靶向治疗以及与微环 境的相互作用等研究中需要迫切解决的难题之一。 因此,我们拟建立一套简捷高效的肿瘤干细胞的单细胞分离技术和培养技术,为相关研究提供技术支持。

目前,单细胞分离方法有4种:

(1)手工机械分离 法:在倒置显微镜下直接分离细胞,但易损伤细胞;

(2) 荧光流式细胞技术分离法:荧光激活流式细胞分离技术能够有效获得单个细胞,但是对流式细胞仪的性能要求较高,仪器价格高昂;

(3)激光显微切割技术:能够从组织中分离单个细胞,但不适用于细胞培养与扩增,且需要操作者极其熟练地掌握切割技术;

(4)显微操控仪: 采用显微操控技术从单细胞悬液中吸取单个细胞,但精细的操作以及贵重的仪器使研究者望而却步。以上技 术的缺陷使之无法得到推广应用,于是有研究人员自行 改良了操作方法,如使用小号静脉注射针及微量移液器 组合进行单细胞分离[11],但是由于肿瘤干细胞粘附性 强,分离时易损伤,效果依然欠佳。因此,我们通过实验 摸索和总结,建立了一套有效防止肿瘤干细胞损伤的简 易单细胞分离技术,并可高效扩增单个肿瘤干细胞。

单个肿瘤干细胞分离及其培养材料

DMEM/F12培养基（Gibco）、Accutase 酶(eBioscience);B27 添加剂,重组人表皮生长因子 (EGF)、重组人碱性成纤维生长因子(bFGF)均购自Invitrogen;白血病抑制因子(LIF)(Millpore);BJ-40 毛细玻璃管(北京正天易公司);人结肠癌 SW480 细胞系 来自 ATCC(美国组织培养保藏中心),由上海生物细胞 所提供。人结直肠癌干细胞 SW480-17 细胞由本课题组自行筛选冻存。

单个肿瘤干细胞分离及其培养实验方法

①配制培养基

无血清培养基由DMEM/F12、B27、 EGF(20 ng/ml)、bFGF(10 ng/ml)、LIF(10 ng/ml)组成。 1.2.2 制备单细胞分离装置 BJ-40 毛细玻璃管(外径 1.0 mm,内径 0.8 mm)置于 1 mol/L 盐酸中浸泡 24 h,然 后用超纯水连续冲洗,65 °C烘干,高压灭菌备用。取出 细玻璃管在酒精灯外焰烧烤数秒,迅速拉成细丝状制成 口吸管。取无菌塑料管 1 段(30~40 cm),两端分别连接 灭菌的 10 μl 和 100 μl 吸头,10 μl 吸头连接口吸管,建立 口控毛细管单细胞分离装置。

种植单细胞 SW480 用胰酶消化后制成单细胞悬 液备用。应用自制的口控毛细管单细胞分离装置于显 微镜下吸取单细胞悬液然后种植于 96 孔板中,每孔中 加入 1 个细胞。

②免疫荧光检测

取单个 SW480 细胞无血清培养 30 d 后的克隆球,4%多聚甲醛固定 20~30 min,PBS 洗 涤,0.2% Triton X-100,室温孵育 10 min,PBS 洗涤, 10%正常羊血清,封闭 30 min,吸取羊血清,CD133、 CK7 抗体标记过夜,PBS 洗涤,荧光标记二抗(FITC、 TRITC),室温闭光孵育 1 h,PBS 洗涤,再在每皿内加 5 μg/ml DAPI 染液核衬染 5 min,PBS 洗涤后荧光显微镜下观察。

③两种结直肠癌干细胞培养方式比较

挑选单个肿瘤干细胞克隆球消化后制成单细胞悬液备用。取 Corning 35 mm × 10 mm 的皿,加入 10 滴培养基,每滴 20 μl,再加入 2 ml 石蜡油,建立微滴培养池。应用自制 的口控毛细管单细胞分离装置于显微镜下吸取单细胞悬液然后在每个液滴用口吹出一个细胞,种植于石蜡油封闭的微滴培养基中。同样方式吸出细胞分别种植于 96 孔板中,每孔中加入 1 个细胞。倒置显微镜下观察细 胞生长30d。

④统计学方法

采用 SPSS13.0 软件处理,计数资料 采用χ2检验,P<0.05 表示差异具有统计学意义。

单个肿瘤干细胞分离及其培养实验结果

无血清培养环境下单个 SW480 细胞在 96 孔板中的克隆形成率为 1.04%(2/192)免疫荧光显示克隆球中 CD133 高表达,CK7 几乎不表达而在血清培养环境下 则 相 反( 图 1 )。

采用口控毛细管单细胞分离装置(图 2)共种植了 199 个微滴,微滴中单细胞的数量为 197 个,单细胞分 离的有效率为 98.99%(197/199),未成功的两个微滴均为 2 个细胞;另种植了2块96孔板共192个孔,其中 单细胞的数量为 184,单细胞分离的有效率为 95.8%(184/192)。

两种培养方式观察比较(图 3、4),第 1 次分裂发生的时间都集中在第 3 天,分裂的概率分别为:微滴培养 24.9%(49/197),96 孔板培养 20.1%(37/184),两者无明 显差别(P>0.05)。微滴培养第 2 次分裂的时间集中在 第 6 天,分裂概率为 20.3%(40/197),而在 96 孔板培养第 2 次分裂集中在第 5 天,分裂概率为 16.8%(31/184),两 者同样无明显差异(P>0.05)。此后微滴中细胞分裂的 时间长于 96 孔板内培养的细胞。11.5%(22/197)的单 细胞在微滴中能够持续扩增 30 d;9.2%(17/184)的单细 胞能够在 96 孔板中能够持续扩增 30 d,两种培养方式 在维持单细胞持续扩增上无明显差别(P>0.05,图 5)。

口控毛细管的单细胞分离装置最初用于卵细胞移植,我们在此基础上简化改造,建立口控毛细管肿瘤 干细胞单细胞分离装置。该装置材料容易获得,不需要 专用设备。毛细玻管在轻烤后管口变得圆滑,口吸操作 力度轻柔可控,能够有效降低分离吸取单细胞时所造成 的机械损伤。采用口控毛细管单细胞分裂装置分离出 来的单个 SW480 细胞能在无血清的培养环境中形成克 隆球,克隆形成率约为 1.04%,并且克隆球中 CD133 的 表达高而 CK7 的表达低,进一步验证为结直肠癌干细胞。此种方法分离单个肿瘤干细胞以口控毛细管单细 胞分离装置为依托,以无血清培养方式筛选肿瘤干细 胞,操作灵活、简单快捷、便于推广,不仅可以分离肿瘤干细胞,而且可用于从混合类型的细胞中挑取单一类型 细胞,具有很好的实用价值。

在单细胞培养技术中,我们选用了微滴培养法。微滴培养法最先由 Brinster 建立,应用于卵细胞培养和胚胎发育研究。2010 年 Araki 等观察研究了小鼠精 原干细胞在微滴中的培养,发现小鼠的精原干细胞同样 可以在微滴中发生扩增,而且此方法也可以用来培养其 他干细胞。

图3 动态观察微滴中培养的单个肿瘤干细胞

图4 动态观察96孔板培养的单个肿瘤干细胞

我们将结直肠癌干细胞作为研究对象,分别接种于微滴和 96 孔板。与传统的 96 孔板培养相比,结直肠癌 干细胞在微滴及 96 孔板中均可获得分裂增生,两者在 分裂时间以及可持续分裂的细胞数量上无显著差异。

但是微滴培养法在操作灵活性及观察便捷性方面具有明显优势:

(1)微滴培养技术可以全方位立体动态观察 目的细胞整个培养过程,并能在分裂的早期阶段再次分 离单个细胞,操作简便快捷,为肿瘤干细胞、肿瘤祖细 胞、移行扩增细胞和成熟肿瘤细胞生物学的动态演变规 律和分子机制研究提供了实验技术基础;

(2)石蜡油液 封的培养微滴可以减少培养基的流失,保持微滴中的 温度、pH 值的稳定,特别是某些珍贵而稀少的培养基,能够充分显现微滴培养的优势,而 96 孔板长时间培养时,培养液易蒸发而改变培养基内环境,影响细胞生长; 

(3)因微滴置于培养皿中,能多角度灵活操作,而传统的 96 孔板孔径比较狭长,种植细胞时候有一定的难度和局 限。综上所述,石蜡油封闭微滴培养法培养单个肿瘤干 细胞有其独特的优势,可以做为培养单个肿瘤干细胞的首选。

图5 两种培养方式比较

因此,我们根据肿瘤干细胞的特性,建立了一套高效可靠的单个肿瘤干细胞的分离和培养方法,该方法操作简单、成功率高,便于推广,可用于肿瘤干细胞的单细 胞研究。石蜡油封闭微滴培养法培养单个肿瘤干细胞有 其独特的优势,可以作为培养单个肿瘤干细胞的首选。