固定化酶微反应器的应用

上个世纪90年代，库尔团队开始利用酶微反应器结合毛细管电泳(CE)技术对蛋白质进行线酶解和谷氨酸盐分析。Fréchet和Svec研究组利用整体柱酶微反应器进行肽谱分析和抗体的研究。目前，固定化酶微反应器的稳定性和催化效率均有了显著的提高，已成为生命科学、化学、药学等领域的研究热点。

作为继人类基因组计划后的又一重大生命科学课题，蛋白质组学是一个非常复杂的生物系统工程。作为shotgun技术的补充，固定化酶微反应器为蛋白质组学的顺利实施提供了有力的支撑。利用所制得的全柱酶微反应器和纳米反相液相色谱-串联质谱联用技术，首次实现了复合蛋白混合物的酶解分析。

结果表明，在590ng酵母蛋白酶解产物中，共鉴定出1578个独立肽段，541个不同蛋白，酶解时间从16小时缩短到1分钟。Liu团队将制备的纳米金胶芯片酶反应器与强阳离子交换-反相层析-电喷雾离子化串联质谱联用，对小鼠巨噬细胞系AMJ2-C8蛋白样品进行酶解和快速分离测定，共497个蛋白质实现了准确的鉴定。在此基础上，Zhang团队利用微反应器构建了多维蛋白质分析平台，为蛋白质组学的高通微量化分析研究奠定了基础。

研究人员使用具有氨基功能的全复合柱胰蛋白酶微反应器与μPRLC-ESI-/MS/MS/MS/MS联用，构建了一种在线蛋白变性、还原、酶解、分离、检测等蛋白质分析平台，使蛋白质样品预处理时间缩短到3.5min。再将点击麦芽糖亲水作用色谱柱、强离子交换预柱、肽-N-糖苷酶F微反应器组成的多级处理系统，实现了多级蛋白样品处理系统的同步实现，能同时进行多肽富集、样品缓冲液的更换以及脱糖基化。

首次用于蛋白质N-连接糖基化位点的研究，可选择性地检测酶解产物糖基糖肽，来自抗生素共存干扰物50倍以上。同时，样品的预处理时间也只需1h左右，而样品的检测限值仅为5fmol。与nanoRPLC-ESI-MS/MS相结合，对6μg大鼠脑液酶解样品进行了分析检测，共检测到120个糖蛋白和196个N-糖基化位点肽，其中有61个是首次发现的。本系统对高通量、高效、高灵敏度的糖蛋白组学检测具有重要意义。酶微反应器还可以用于药物的高通量筛选。

酶靶向抑制剂药物的筛选是目前分子靶向药物研究的一个重要方向。酶微反应器是一种高效、自动化的药物筛选方法，但传统的药物筛选方法效率低、能耗高。阿兹海默病(AD)被称为老年痴呆症，是一种广泛关注的老年疾病。AD的发生与乙酰胆碱酯酶(AChE)密切相关，在临床上应用较多的是AchE抑制剂。

通过CE和AchE的联合应用，对AChE抑制剂进行了筛选，从40多个天然药物库中快速筛选到4个AchE抑制剂。由于CE筛选出的药物峰容量不足，用磁性聚苯乙烯微球作为载体，结合CE进行碱性磷酸酶毛细管微反应器的筛选，峰容量提高了20倍。抗癌药物前药活性是药物开发的重要组成部分。通过与HPLC相结合，对硝基苯硝基还原酶进行抗肿瘤药物的筛选。在线酶抑制剂的筛选中，毛细管整体柱腺苷脱氨酶酶反应器与nanoLC相结合。酶微反应器作为一种绿色环保、高效易控的催化合成技术，近年来在生物转化方面也日益受到关注。

采用白念珠菌酯酶B反应器进行内酯聚合，可以得到比传统聚合反应大得多的产物。采用脂肪酶PS微膜反应器进行了苯醇和醋酸乙烯酯的手性催化酯交换反应，3维立方结构MPS膜载体制备的微反应器，转化率高达64%，手性选择性大于99%。

采用酯酶微反应器对乙酸异戊酯进行生物合成，比传统方法提高3倍。在此基础上，采用脂肪酶反应器选择性合成C-6位羟基乙酰化。本发明的反应时间缩短到30分钟，并具有较高的收率和选择性。同时，利用酶微反应器对酶性能进行评价。以葡萄糖氧化酶为模型，用固定化酶微反应器研究酶动力学。实验结果表明，微反应器富集酶活性较好，酶学参数与浓度有较好的线性关系。酶的活性是微反应器的一个重要性能指标。对酶活性评价方法进行了相关研究，为活性表征提供了简便而有效的方法。

用胰蛋白酶结合纤维素膜形成一种填充层析。采用HPLC前沿分析方法，在线监测胰蛋白酶底物N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺的水解产物中硝基苯胺的含量，并计算胰蛋白酶底物中硝基苯胺的含量，从而评价固定酶活性。用胰蛋白酶在多孔硅载体上进行共价键合，与离子化质谱相结合，检测酶催化底物产生的产物的量，从而测定酶活性。

另外，多种酶结构的微反应器也被广泛应用于生化级联反应。以蔗糖酶、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化酶在微通道中分段固定，通过反应物进入通道，通过调节三种酶的固定顺序，观察酶的生成顺序对产生产量的影响。用谷氨酸脱氢酶与谷丙转氨酶同时固定于毛细管内壁，通过循环反应产生信号放大效应，用于谷氨酸含量的高灵敏度检测。