微流控芯片在骨科疾病中的应用及前景

随着老龄化社会的到来，与骨相关的疾病，例如骨质疏松症已经成为人类的主要健康问题，并且由癌症骨转移引起的溶骨性病变的预后一直很差。研究人员已经研究了这些骨科疾病的发病机理，从而获得了有效的治疗方法。微流体芯片技术是近年来开发的流行技术。这项技术可以建立一个仿生的实验平台，在体内微环境体外，这已经受到越来越多的研究人员的青睐。在这篇综述中，我们将以骨质疏松症和癌症骨转移为例来说明发病机理，介绍微流体模型与骨科相关疾病研究的最新进展，并描述当前的方法及其局限性。

介绍

骨科作为现代临床医学的重要分支，主要研究骨骼肌系统的生理学和病理学，并借助药物、外科手术或其他物理手段维持该系统的正常功能和形态。随着社会的进步和时代的变迁，骨科的伤害谱也发生了巨大变化。例如普遍地减少了诸如脊髓灰质炎、骨髓炎、骨骼和结核病之类的疾病，但是交通事故造成的创伤大大增加了。人口老龄化还导致了老年性骨质疏松症，类风湿性关节炎和骨肿瘤的相应增加。这种变化表明，骨科研究的重点也必须适应骨科的未来发展。骨科的未来发展不仅应加强与基础医学的融合，而且应将其他学科的研究成果转化为可用的技术。例如，人工关节的进一步改进离不开材料科学和技术的发展。及时有效地将其他学科的新技术成果应用于临床骨科，可以大大改善骨科疾病的诊断和治疗。

近年来，微流控芯片技术逐渐普及，在生物医学研究等领域显示出广阔的应用前景。细胞是生命活动的基本单位。近年来，细胞研究已从细胞水平发展到分子水平，形态学研究确定了亚微观结构和分子结构，以进一步了解生命活动和发展的规律。微流控芯片技术的出现被认为是细胞研究的新的重要技术平台。微流控芯片也称为“芯片实验室”，是一种将生物，化学和其他实验集成在几平方厘米的芯片上的新型科学技术，该芯片可以集成样品制备、反应、分离并检测为一体。

细胞研究中使用的微流控芯片技术具有以下优点：1）芯片尺寸小，通常可以控制在10–100μm的范围内，而哺乳动物细胞的直径大约为10–20μm，适用于它的成长；2）芯片的通道环境相对封闭，可以构建多维网络结构，可以形成接近生理状态的细胞空间特征；3）微观通道环境增加了传热，传质和气体交换的速率；4）可用于高通量细胞分析，可同时采集多种生物信号；5）芯片上的多个单元可以灵活组合，并且可以进行集成的细胞研究。因此，细胞注射，培养，筛选，裂解，分离和检测可以集成在同一芯片上。除了可控制的芯片结构外，还有许多芯片材料可供选择。聚二甲基硅氧烷（PDMS）是一种高分子量有机硅化合物，是制备微流控芯片中使用最广泛的材料之一。

将生物医学临床研究与微流控芯片技术相结合可以将这项技术带入一个新的领域，也可以在生物医学研究中取得一些突破。本文以整形外科中最常见的情况，骨质疏松和癌细胞转移为例，并列举了微流控芯片技术发挥的重要作用。

骨质疏松微流模型的建立与应用

骨质疏松症是目前临床上最常见的骨科代谢疾病之一。这是由于每单位体积的骨量减少和骨微结构破坏的多种原因引起的。临床特征主要是骨痛，骨脆性增加和容易骨折。骨质疏松症可分为三类：原发性，继发性和特发性。原发性骨质疏松症约占90％，分为I型（绝经后骨质疏松症，PMOP）和II型（老年性骨质疏松症，SOP）。继发性骨质疏松症是由诸如糖尿病，甲状腺功能低下，白血病和恶性肿瘤等疾病或使用诸如糖皮质激素，肝素和免疫抑制剂等药物引起的。特发性骨质疏松症在8-14岁的青少年中更为常见。

在过去的20年中，人们还通过各种方式研究了骨质疏松症的病理过程。他们表明，在骨重建过程中骨形成缺陷是骨质疏松症的主要病理机制。在压力原理下，骨骼不断更新，破骨细胞去除旧骨（骨吸收），然后成骨细胞添加新骨（骨形成）。当成骨细胞介导的骨形成不如破骨细胞吸收骨有效时，就会发生骨质流失，骨矿物质密度（BMD）降低，严重时会发生骨质疏松症（Bartelt等，2018）。在细胞水平上，成骨细胞和破骨细胞的相互作用和偶联构成了骨骼的最小功能单元，一些重要的分子在骨骼重建过程中协调了这两个细胞之间的活动（Kim和Koh，2019年））。破骨细胞是源自造血干细胞的单核细胞-巨噬细胞前体分支。完全活化的多核破骨细胞与破骨细胞前体细胞不同。分化过程受巨噬细胞集落刺激因子和核因子-κB配体的受体激活剂（RANKL）的调节。许多不同的激素和炎性因子通过RANKL途径调节破骨细胞的生理功能。成骨细胞不同于骨髓间充质干细胞。前体细胞分化为成熟成骨细胞的速率和效率以及成骨细胞的寿命决定了骨形成的速率（Chen等，2018）。在分子水平上，经典Wnt /βcatenin途径的激活是成骨细胞分化的重要开关。骨硬化蛋白和Dickkopf1相关蛋白1（Dkk1）通过结合并破坏Wnt受体LRP-5来抑制该合成代谢途径。成骨细胞释放硬化分子和Dkk1等信号分子，使成骨细胞保持静止。周期性的机械负荷可以通过骨细胞下调这些抑制因子的表达水平，从而激活成骨细胞的发育以形成新的骨。一项小鼠尺骨负荷研究表明，在尺骨的较高应变区域中，骨硬化蛋白的产生显着减少，并且在这些位点7天后，这些部位的局部成骨作用也得到了增强Robling等2008这些监管机制非常重要，并且是新药开发的主要目标。例如，针对硬化蛋白和Dkk1的抗体可在临床上用于治疗溶骨性病变和骨质疏松症。

因此，成骨分化和骨重塑是治疗骨质疏松症的关键，但由于各种原因，成骨细胞的体内研究仍面临重大挑战。维持原代骨细胞的原始生理功能很困难。即使在借助生物支架进行3D培养，生物反应器中的动态灌注以及施加机械载荷的情况下，成骨细胞在体外培养过程中也难以形成稳定的3D网络结构。例如，Boukhechba等2009年使用双相磷酸钙（BCP）颗粒培养人类原代成骨细胞。与二维培养相比，向成骨细胞样表型的分化显着，成骨细胞特异性标志物被下调，而成骨细胞标志物被上调。但是，在40-80μm的BCP颗粒间隙中会生成随机细胞聚集体，并且不会生成有序的3D细胞网络。为了模拟体外的骨骼重塑环境，Mulcahy等人2011年使用Matrigel中的仿生细胞自我仿生过程成功地将骨细胞样小鼠细胞系（MLO-Y4）培养成3D网格结构，但该结构中的细胞间距约为100μm，无法控制为模拟小鼠骨骼的大小为20–30μm。细胞大小对于骨骼细胞生长和机械传导过程中的信号传递非常重要。同样，随着凝胶培养时间的增加，骨细胞在28天后自由增殖并最终破坏了原始的有序细胞网络结构。

微流体3D组织模型可以更好地模拟生理和临床相关的微环境。Lee等2012年集成了带有微图案和微流体装置的载玻片，该载玻片上有八个由聚二甲基硅氧烷制成的培养室，并在微流体培养室中成功地培养了3D“初级骨组织”。需要进一步的研究以确定成骨细胞是否可能已经分化为骨细胞，并且组织结构的强度不足以应付机械负荷。如图1A所示，Gu等2015年探索了一种新的仿生方法来复制3D骨骼网络结构。他们在PDMS微流腔室中组装了大小为20–25 µm的双相磷酸钙微珠和鼠早期骨细胞（MLO-A5），以模拟3D泪管结构的生理微环境。可以通过长期微流灌注来培养骨细胞，最后获得了致密且机械稳定的3D网络组织结构。该方法可用于观察成骨细胞的矿物质沉积，并已广泛用于体外研究骨细胞的机械转导。乔治等2018建立了一个生理芯片实验室（LOC），以整合三种主要类型的骨细胞（成骨细胞，成骨细胞和破骨细胞）并消除时空限制。该平台有助于机械负载和骨骼重塑。为了更好地观察细胞，Sheyn等2019准备了PDMS微流体骨芯片，将其与光学成像方法相结合以实时监测细胞存活，增殖和成骨分化。证明在恒定和连续的介质流动条件下，细胞的成骨分化更高。该芯片设计可以提供一个平台，用于体外测试细胞对环境的反应以及细胞的光学成像。

图1.微流体骨组织模型的例子。（A）通过微珠引导的重建在微流室内培养3D骨网络结构。（B）一种微流控芯片，可同时测量细胞侵袭和外渗。（C） 3D矿化的胶原蛋白骨组织芯片，用于乳腺癌细胞和成骨细胞的共培养。

此外，已经开发了许多基于成骨细胞的用于药物筛选的3D微型系统。例如，Nason等2011年设计了一种微流控设备，用于细胞药理学的体外测试，以此作为区分浓度范围的工具，该浓度范围保证了该药物对雷奈酸锶的抗骨质疏松症治疗的有效性。

通过微流控技术探讨骨转移的机制

许多癌症，包括前列腺癌，乳腺癌，多发性骨髓瘤和肺癌，在晚期阶段都有很高的骨转移可能性，导致存活率显着下降（Hao等，2018）。这些转移可引起一系列与骨骼有关的疾病，例如脊髓压迫，病理性骨折，高钙血症和骨痛。尽管采取了多种治疗策略，但转移性骨病的预后很差（Wu等，2017）。因此，有必要构建仿生骨微环境的骨转移模型，以更好地了解恶性骨转移，并开发出新的有效的骨转移治疗方法。在过去的几十年中，涉及三维细胞培养的研究已大大缩小了体外细胞培养模型与体内动物模型之间的差距（Chaicharoenaudomrung等，2019）。1989年，斯蒂芬·佩吉特（Stephen Paget）提出了“种子和土壤”假说，将癌细胞的转移与植物种子的传播进行了比较。为了促进转移灶的形成，“土壤”（即元环境）必须能够滋养“种子”（即癌细胞扩散）（Paget，1989年））。当发生骨转移时，癌细胞会渗出并经历持续的液体微环境。因此，在对转移性微环境进行建模时，需要考虑癌细胞所经历的流体压力。因此，具有高通量和轻量特性的微流体系统引起了许多研究者的关注。该系统使用很少的试剂即可达到很高的分析精度和灵敏度，并且可以在体外构建类似于人体的3D流动环境。

低流体条件的流体压力平衡，这有助于内皮和功能性微通道管腔融合，并为恶性肿瘤提供营养支持。与在2D生物学平台上培养的细胞相比，在微流体生物学系统中培养的癌细胞形成球形细胞聚集体，这些聚集体的上皮标志物（例如CD326）的表达水平下调，而间质标志物（例如，波形蛋白，N-钙黏着蛋白和纤连蛋白）增加（Kuo等人，2012）。在癌症骨转移过程中，骨质疏松癌细胞经历内皮运动（浸润和渗出）和定向迁移。穿过内皮的渗透速度与基质细胞和癌细胞之间的主动相互作用有关，癌细胞的靶向迁移取决于归巢位点的化学吸引力。迄今为止，许多研究人员已经使用微流体系统建立诱导因子的浓度梯度，模拟跨内皮迁移过程中内皮网络对癌细胞施加的剪切应力刺激，并且更实际地模拟循环系统中癌细胞的状态。在微流控芯片的帮助下建立的流体动力学模型可以评估形态，遗传物质，和与肿瘤细胞迁移相关的蛋白质水平。模拟更接近的微环境在体内条件下，Huang等2009年制造了一个平行的微流体通道，该通道由规则间隔的柱的线性阵列分隔开，这些通道可以在3D ECM环境中基于自分泌或旁分泌信号分子对细胞之间的实时相互作用进行成像。维克曼等2008年开发了一种微流体平台，用于在生物衍生或合成水凝胶中进行三维细胞培养，可以实时监测细胞动态。通过调节刺激因子，例如表皮生长因子（EGF），CXCL12和间质血流，Polacheck等2011年成功地将癌细胞穿过单层内皮细胞迁移到微流控设备中的胶原凝胶中，这表明癌细胞渗出过程得到了很好的模拟。此外，如图1B所示，Shin等人2011年设计了带有两个主要培养室的微流控芯片。腔室I是用于细胞迁移和侵袭测定的血管内腔，腔室E是用于定量检测的渗出腔。该平台可以同时模拟癌症转移中的浸润和外渗过程。该结果表明，在血管腔中，癌细胞可以在强应力下从基质凝胶分离，然后粘附在血管外腔中的粘附分子上。

微流体装置可以模拟骨骼环境，并有助于癌症的动态骨转移过程。Hsiao等2009年将包含内皮细胞，成骨细胞和前列腺癌细胞的三培养细胞球接种到微流控生物芯片中。该微流控芯片可以实时监测球体内细胞的生长，并可以抑制前列腺癌细胞的增殖而不会损害其他细胞的生存能力。Jeon等2015在体外开发了PDMS微流体3D通过软光刻技术建立模型，将内皮细胞和骨间充质干细胞（BMSC）共培养，建立血管化的骨样微环境，可用于研究乳腺癌细胞的外渗。巧合的是，Bersini等2014年设计了一种用于内皮细胞和BMSCs的血管化微流控设备，包括三个培养基通道和四个独立的凝胶通道，并引入了乳腺癌MDA-MB-231细胞以形成外渗癌细胞的微转移模型。如图1C所示，Hao等2018设计了一种微流体骨芯片，该芯片由顶部培养基储库和底部细胞生长室组成，该室由透析膜隔开。骨屑可以自发生长为厚度为85μm的成熟3D矿化胶原蛋白骨组织，其中包含大量矿化的胶原蛋白纤维。胶原纤维在720小时内自然形成，无需分化剂。它们还使癌细胞与骨基质相互作用的机会最大化，并且可以经常观察到。由于小型化，简单的操作和超低的单位成本，这种自发的3D模型将指导体外癌症骨转移的研究。

结论与未来展望

微流体技术可以通过结合功能化细胞，细胞外基质，细胞生长因子和其他生化刺激物来模拟体内骨骼细胞的动态微环境。该技术有助于评估细胞间的相互作用，从而阐明与骨相关的疾病（如骨质疏松症和骨转移癌）的发病机理，并可以导致开发新的治疗策略。

但是，这项技术在骨科领域得到广泛应用之前还有很长的路要走。一方面，人体的内部环境复杂细腻，目前的模型无法模拟整个系统。特别是在骨转移过程中，癌细胞经历了连续且密切相关的多步过程，包括许多不可分割的细胞事件（Qiao and Tang，2018年）。）。另一方面，许多微流体疾病模型现在使用永生化细胞系代替患者来源的活细胞。使用个性化细胞代替细胞系可以帮助开发定制疗法，从而更有效地指导患者治疗。在过去的十年中，在再生医学中已经广泛研究了诱导多能干细胞（iPSC）。它们被认为是工程骨组织的有效细胞来源，并且在体外研究中具有强大的骨再生潜力（Rana等，2019）。观察和评估iPSC与微流体技术的相互作用是未来研究的新思路，它在研究与骨相关的疾病（如骨质疏松症和骨转移）的发病机理方面具有巨大的潜力，并有助于开发新的治疗策略。总的来说，使用微流控芯片技术产生仿生骨骼微环境取得了令人鼓舞的进展，研究人员需要继续努力，以更好地了解骨骼疾病的机制，治愈与骨有关的疾病并改善人类的生活质量。

来源：Yang X, Tang Q, Lai C, Wu K and Shi X (2021) Applications and Prospects of Microfluidic Chips in Orthopaedic Diseases. Front. Mater. 7:610558. doi: 10.3389/fmats.2020.610558

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