基于时间分辨免疫分析的冰毒检测微流控芯片
研制了一种聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)-多聚赖氨酸(Poly-l-lysine,PLL)玻片杂合微流控芯片,每张芯片有24条反应通道,每条反应通道体积仅为2.5微升,实现了基于时间分辨免疫分析技术的高通量冰毒(Methamphetamine,MET)定量检测。此芯片利用PDMS和PLL对蛋白质的吸附特性在反应通道内表面固定冰毒完全抗原(MET-BSA),使其与待测样品中的冰毒抗原(MET-Ag)共同竞争标记有冰毒抗体(MET-Ab)的乳胶微球。乳胶微球表面标记了镧系元素,在紫外光的照射下会发出红色荧光,根据竞争法检测原理,冰毒浓度越高,与反应通道内表面冰毒完全抗原结合的乳胶微球数量越少,所发出荧光强度越低。本芯片的结果读取采用紫外照射荧光成像方法,仅需对芯片拍摄荧光图像,即可实现24个样本的同时检测分析。本方法样品消耗量少,通量大,可以在100~3000ng/mL浓度范围内实现对冰毒的定量检测,可用于缉毒的初步筛查,具有较好的应用前景。
1引言
冰毒,即甲基苯丙胺,又名甲基安非他命(Methamphetamine,MET),在大部分地区已经赶超海洛因,仅次于大麻,成为最主要的涉案毒品种类,可致人成瘾,长期服用会损坏服用者认知,导致精神混乱、器官衰竭,不仅危害个人健康,还严重危害社会治安。人吸食冰毒后,约43%未降解的原药会在尿液排泄出来,在尿液中可检出甲基安非他命、安非他命、对羟基甲基安非他命、对羟基安非他命,冰毒滥用者服用纯品冰毒后,24h内尿中冰毒浓度均超过1000ng/mL。目前,在缉毒领域,检测冰毒的胶体金免疫检测测试卡灵敏度为1000ng/mL,如果吸毒者吸食的是混合毒品,则其尿液中冰毒的含量会降低,使用胶体金测试卡可能出现漏检的情况[4,5]。高效液相色谱法和气相色谱-质谱联用分析法准确且重复性好,是检测冰毒的最终确认方法,但是检测仪器昂贵且操作复杂,不适合初步的大量样品筛查使用。其它毒品检测的方法,包括化学显色法、色谱-质谱法、色谱-光谱法、毛细管电泳法等,比较依赖大型仪器,或难以实现高通量测定。因此,需要建立新的冰毒检测方法,以满足简单、高通量、快速的现场检测需求。时间分辨免疫荧光技术具有较高的分析灵敏度,微流控芯片技术易于实现高通量检测且操作简单,将两种技术结合起来可望实现便捷的高通量冰毒检测。
标记免疫分析是标记技术与免疫分析技术相结合的一种分析测定技术,自1959年使用放射性同位素为标记物以来,各种新型标记物不断出现,如以酶为标记物的酶标免疫分析、以胶体金为标记物的胶体金免疫分析、以化学发光底物为标记物的化学发光免疫分析、以电化学为基础的电化学发光免疫分析,还有以镧系稀土元素为标记物的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)等。其中常用于TRFIA的元素有镧系元素铕、钐、铽和镝及其螯合物,相比于传统的酶、胶体金、化学发光底物等标记物,具有较大的Stokes位移,荧光强度高,半衰期长,激发光谱较宽,而发射光谱很窄,此外,它还具有制备简便、无放射性污染、可重复激发测量等优越性,在临床免疫和科学实验中应用越来越广。我国是稀土储量大国,对TRFIA进行深入研究并推广应用,对我国生物医学检测的发展具有重要意义。
微流控芯片是将传统生物化学实验室中进行的实验操作集成到一张数平方厘米的芯片上,通过芯片结构的设计、多种功能单元的配合,实现试剂的操控、生化反应的进行以及反应结果的检测。聚二甲基硅氧烷(,PDMS)属于热固化型材料,能透过250nm以上的紫外光与可见光,具有加工简单、可塑性强、成本低廉,以及无色透明、有弹性、透气性好、有良好的生物兼容性等优点，常被用于制作微流控芯片。微流控芯片由于其消耗样本少、成本低、操作简单等优点,也被应用到了毒品检测当中。Andreou等在微流控芯片的通道中实现了盐溶液、唾液样本以及银纳米粒子的稳定层流,可在几分钟内检测出唾液中冰毒的含量。Bailey研究组在玻璃微流控芯片上设计了细长的毛细管通道,实现了微流控芯片毛细管电泳,成功地在芯片上实现了苯丙胺及其类似物的分离检测。Greenwood等利用化学发光法,在一张玻璃微流控芯片上对阿托品和杜冷丁进行了检测,检出限分别可以达到3.8伊10-9mol/L和7.7伊10-8mol/L。上述各方法利用微流控芯片与其它技术结合的方式实现了毒品检测,但是操作相对复杂,通量较小,因此,需要构建新的高通量微流控芯片方法用于毒品的检测。
本研究制作了PDMS-多聚赖氨酸(Poly-l-lysine,PLL)玻片杂合微流控芯片,将TRFIA技术与微流控芯片技术相结合,采用竞争法的原理,实现了冰毒的时间分辨免疫荧光检测。每张芯片可同时检测24个样本。冰毒抗体偶联在Eu标记的聚苯乙烯乳胶微球上,在365nm紫外光激发下,标记物可发射610nm红色荧光,可将冰毒的浓度转化为荧光强度,通过对荧光图像进行分析可得到样本中冰毒浓度。此芯片实现了100~3000ng/mL浓度范围内冰毒标准品的高通量定量分析,具有较大的检测范围和较低的检出限,能够对吸食纯品冰毒及含冰毒的混合毒品的人员体内冰毒含量进行定量检测,避免了漏检情况的发生,对于打击毒品犯罪、开展禁毒戒毒工作具有重要意义。
2实验部分
2. 1仪器与试剂
G3P-8旋转涂覆机；KW-4AH烤胶机；SERIES-60平行紫外曝光机；ARV-310液体混合真空搅拌机；FG-5001空气等离子体处理机；打孔器；TGL-16G离心机；SHP-150生化培养箱；GelDoc2000型紫外凝胶成像系统；LSP02-18注射泵；湿盒。
四寸单晶硅片；光刻胶SU8-2075、SU8-3025、显影液；异丙醇、甲苯、无水乙醇；三甲基氯硅烷；聚二甲基硅氧烷；多聚赖氨酸玻片；PBS缓冲液；无RNA酶超纯水；牛血清白蛋白、Tween-20；冰毒完全抗原；冰毒标准品、标记冰毒抗体的乳胶微球。
2.2实验方法
2.2.1模具的制作玻璃-PDMS芯片的制作
芯片的结构如图1所示,主要由通道层和其下方的PLL玻片组成。
(1) 通道层的制作首先用1mL三甲基氯硅烷滴加在模具表面,静置10min,以利于脱模;配制25g单体与固化剂比例为10颐1的PDMS,混匀脱气后倒在模具上,85益加热40min,得到厚约4mm的PDMS通道层;将PDMS通道层从模具表面揭下,使用直径1mm的打孔器,在进样口与出样口处打孔,切割掉边缘多余的PDMS,即得到芯片通道层。
(2) 通道层与PLL玻片的封接配制2g单体与固化剂比例为5颐1的PDMS,将其与甲苯按照质量比1颐6混合均匀,将此混合液倒在干净的硅片上,以1000r/min的速度旋转20s。将PDMS通道层下表面进行氧等离子体处理,将其置于均匀涂覆了甲苯-PDMS的硅片表面,随后将沾有甲苯-PDMS混合液的PDMS通道层与PLL玻片贴合,85益加热24h,即得到芯片。
图1冰毒检测微流控芯片:(A)芯片结构示意图;(B)芯片实物图。Fig.1Microfluidicchipformethamphetamine(MET)detection:(A)schematicdiagramofMETdetectionchip,and(B)photoofMETdetectionchip.
2.2.3实验操作步骤
实验操作步骤如图2所示,(1)包被MET-BSA将2.5微升200滋g/mLMET-BSA加入反应通道,将芯片放入湿盒中,4益孵育过夜,抽出MET-BSA完全抗原后,用注射泵以5微升/min的速度加入PBST(1伊PBS+0.05%Tween-20),37益放置1h;(2)竞争反应用连接了MET-Ab的2.4滋g/mL乳胶微球溶液将MET-Ag梯度稀释,取2.5微升通入反应通道,在室温下竞争反应60min,使用注射泵以5微升/min的速度用15微升PBST清洗反应通道;
(3)成像分析使用紫外凝胶成像仪对芯片的检测结果进行成像,曝光时间为4s,得到芯片上每条反应通道的荧光图像,使用ImageJ软件对每条反应通道的平均灰度值进行数据统计与分析,用软件OriginPro8.0处理数据,得到检测结果。
图2基于时间分辨荧光免疫竞争法检测冰毒的步骤示意图Fig.2SchematicdiagramofMETdetectionbasedontime-resolvedcompetitivefluoroimmunoassay
3结果与讨论
3. 1PDMS-PLL杂合芯片
芯片主要由两部分组成:PDMS制作的带有反应通道和进出口的通道层以及PLL玻片。芯片如图1B所示,一张芯片上有24条反应通道,能够同时检测24个样本,也可以根据需要选择合适数量的通道进行检测。每条通道宽500滋m,高280滋m,长5.5mm,进样口与出样口直径1mm,可通入待测样本的体积约为2.5微升。24条反应通道之间相互独立,不存在相互污染与干扰等问题。
3.2芯片材料选择
PDMS与PLL均具有很好的蛋白质吸附性能。为了选择更合适的芯片材料,分别制作了以PDMS为通道底面的PDMS-PDMS微流控芯片和以PLL玻片为通道底面的PDMS-PLL杂合微流控芯片,两种芯片的规格一致。为了比较两种芯片吸附MET-BSA完全抗原的能力,同时将2.5微升200滋g/mLMET-BSA完全抗原注射进两张芯片的反应通道中,4益下孵育过夜,随后加入PBST,37益放置1h,然后用MET抗体浓度为2.4滋g/mL的乳胶微球作为荧光指示剂通入包被了MET-BSA的反应通道中,室温下进行免疫反应1h,使用PBST冲洗后,在紫外凝胶成像仪中拍摄芯片的荧光图像。荧光强度越强表示固定在通道表面的完全抗原越多。对比结果如图3A和3B所示,两张图的第一行为阴性对照,用PBS配制1%BSA溶液代替MET-BSA包被通道,未观察到荧光,表明没有非特异性吸附,后3行为实验组,均观察到荧光,并且图2B比图2A荧光强度高。统计图3A与图3B中的实验组荧光强度并绘制荧光强度柱状图,得到图3C。由图3C可见,PDMS-PLL芯片荧光的灰度值高于PDMS-PDMS芯片约一倍,并且均一性也更好。 造成这一现象的原因是BSA的等电点为4.9,在pH7.4的PBS溶液中BSA带负电,而PLL玻片带正电,因此PDMS-PLL芯片对MET-BSA的吸附能力更强,所以PDMS-PLL芯片产生荧光强度更高。PDMS-PLL芯片中PLL玻片是亲水的,与全疏水的PDMS-PDMS芯片相比,在包被冲洗过程中更不容易产生气泡,所以产生荧光的均一性更好。因此选用PLL玻片作为通道底面。
图3(A)PDMS-PDMS芯片检测MET-Ab的结果荧光图;(B)PDMS-PLL芯片检测MET-Ab的结果荧光图;(C)PDMS-PDMS芯片和PDMS-PLL芯片中实验组荧光强度柱状对比图Fig.3(A)FluorescentimageofdetectionresultsofMET-AbonPDMS-PDMSmicrofluidicchip;(B)fluorescentimageofdetectionresultsofMET-AbonPDMS-PLLmicrofluidicchip;(C)histogramofintensitiesoffluorescenceofexperimentalgroupsinFig.3AandFig.3B
3.3乳胶微球浓度梯度检测
本研究采用免疫竞争法,因此偶联了MET-Ab的乳胶微球的浓度是关键因素,其浓度越高,检测范围越大。优化了乳胶微球最佳浓度,通道内用过量的200滋g/mLMET-BSA完全抗原包被,乳胶微球从最高浓度2.4滋g/mL用PBST依次稀释到1.68、1.20、0.72和0.24滋g/mL。从图4A可见,第一排的阴性对照组没有荧光,说明没有非特异性吸附,随着偶联MET-Ab的乳胶微球的浓度升高,其它通道荧光强度也逐渐增强,由图4A可知,荧光强度与抗体浓度成正比,且同一浓度MET抗体的反应通道之间的荧光强度相差不大,这说明设计的PDMS-PLL芯片能够将MET-BSA均匀地固定在反应通道内壁,且无非特异性吸附。由图4B可知,荧光强度与抗体浓度有较好的线性关系,说明芯片可将不同浓度的抗体检测结果很好地反映出来,可用于冰毒检测。如图4B所示,当乳胶微球的浓度为2.4滋g/mL时,仍不能占用所有的MET-BSA位点,因此选取最高偶联MET-Ab的乳胶微球浓度2.4滋g/mL作为竞争反应中的浓度。
图4(A)PDMS-PLL杂合芯片检测梯度连接在乳胶微球上的MET-Ab的荧光图;(B)对应图(A)的“乳胶微球-灰度值冶曲线Fig.4FluorescenceimageofdetectionofgradientMET-AbconjugatedtolatexmicrospheresonPDMS-PLLchip;(B)curveof“concentrationofMET-Abconjugatedtolatexmicrospheres-theintensityoffluorescence冶correspondingtoFig.4A
3.4冰毒的检测
将MET-BSA包被在芯片反应通道内表面,样本中的MET-Ag会与MET-BSA竞争偶联在荧光乳胶微球上的MET-Ab,因此最终反应通道中的荧光强度越弱,说明样本中的MET-Ag含量越高。将MET-Ag标准品用2.4滋g/mL乳胶微球稀释至3000、1000、750、500、200和100ng/mL,各取2.5微升,分别加入反应通道,在室温下竞争反应1h,随后使用PBST冲洗反应通道。
使用紫外凝胶成像仪获取反应后的芯片的荧光图像。如图5A所示,1~3为3组重复实验,每组从上而下的6条通道中MET-Ag的浓度逐渐降低,随着MET-Ag浓度降低,荧光逐渐增强;第1列的前3行为空白对照,反应通道内未包被MET-BSA;第1列的后3行为阴性对照,竞争反应时MET-Ag浓度为0。随着MET-*Ag浓度升高,荧光强度减弱。使用ImageJ软件获取图中每条反应通道的荧光强度值,做“MET浓度-荧光强度冶标准曲线,如图5B所示,随着样品中MET-Ag浓度的升高,对应反应通道的荧光强度逐渐降低。当MET-Ag浓度为100~1000ng/mL时,反应通道中的荧光强度迅速下降;而MET-Ag浓度高于3000ng/mL时,荧光强度逐渐趋于平稳。当通道表面修饰的MET-BSA浓度为200滋g/mL,使用乳胶微球浓度为2.4滋g/mL时,PDMS-PLL芯片可在100~3000ng/mL浓度范围内实现对冰毒的测定。
图5(A)芯片对冰毒标准品的梯度检测荧光图;(B)对应图(A)的“冰毒标准品浓度-灰度值冶曲线Fig.5(A)FluorescentimageofgradientdetectionresultsofMET-AgonPDMS-PLLchip;(B)curveof“MET-Agconcentrationversusintensityoffluorescence冶correspondingtoFig.5A
4结论
本研究使用PDMS与PLL玻片设计并制作了一种PDMS-PLL杂合微流控芯片,并利用TRFIA原理在芯片上实现了对冰毒的高通量检测。此芯片仅利用PDMS与PLL材料自身的特性即可实现MET-Ag的均匀包被,无需使用其它试剂反复修饰反应通道,制作简单,成本低廉。每个反应通道体积仅为2.5微升,所需样本量小。每张芯片能够在70~80min内同时检测24个独立的冰毒样本,检测通量高,且仅需一次紫外荧光成像即可得到全部24个样本的检测结果,可实现100~3000ng/mL浓度范围内冰毒的定量检测,检测灵敏度高,动态范围大,有望应用于现场即时毒品检测。
（文章来源:分析化学DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.181216作者：孙敬敬宋祺牟颖转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）