微流控芯片层流技术

1.什么是微流控层流技术？

基于微型通道自身的层流特点而发展起来的多相层流技术 , 从最初的液-液微萃取开始 ,由于其结构加工简单、操作方便和分析功能强大 ,已逐渐发展成为一种加工分析方法 ,为微流控分析的研究应用打开了一个崭新的局面。

自从微全分析系统的概念提出以来 , 由于微流控芯片分析本身具有试样消耗少、分析时间短、效率高、尺寸小、集成度高和便携等优点 ,在短短的 10 余年中就已经发展成为当前世界上最前沿的科技领域之一。

其中微流控芯片是1990年代初中期在分析化学领域发展起来的一门新型的分析科学。该门学科以分析化学为理论基础 , 结合微机电 (micro electrical mechanical systems , MEMS) 加工技术方法 , 主要以微管道网络为结构特征 , 被广泛应用于分离 分析、生物科学和生命医学研究等众多领域 , 是当前微全分析系统领域发展的重点。基于微通道的特点而发展起来的多相层流技术分析方法 , 由于其结构加工简单、操作方便易行、分析功能强大和应 用前景广泛等优势而得到人们的普遍关注。目前 , 已经有大量文献报道采用层流技术实现了微流控芯片通道的加工制作 , 如液-液萃取、过滤和无膜扩散、聚合物薄膜的制备、纳米材料的制备、细胞的研究和有机反应的控制检测等。不可否认 , 多相层流分离微流控系统为微全分析系统的研究应用打开了一个崭新的局面 , 在微芯片上实现样品采集和预处理、试剂分离提纯、在线检测和数据采集一体化起到了重要作用。随着其自身理论的不断完善和发展微流控层流技术必将在未来的应用领域发挥更大的作用。

2.微流控层流技术原理

雷诺实验表明 , 流体的流动状况不仅与流体的流速 u 有关 , 而且与流体的密度ρ、粘度 μ和流体通道的几何尺寸(如圆形管道的管径 d) 有关。由此得到 Re = duρΠμ, 其中 Re 即为雷诺数 ,用以判断流体的流动型态 :该式表明雷诺数与管径、流体流速、 流体密度成正比 , 与流体的粘度成反比 , 其实质反映了流体流动中惯性力与粘滞力的对比关系。流体的流动型态根据雷诺数 Re 的大小可以分为层流和 湍流两种型态。当流体流速较小时 , 流体质点只能 沿流动方向做一维运动 , 与其周围的流体间无宏观 的混合 , 即分层流动 , 而且流体的流速稳定 ,这种 流动型态即为层流 ;当流体流速增大到某个值后 , 流体质点除流动方向上的运动之外 , 还向其它方向 做随机运动 , 即存在流体质点的不规则脉动 , 彼此混合即为湍流。当惯性力占主导地位时 , Re 较大 , 湍流程度较大 ;当粘滞力占主导地位时 , 则 Re 较小 , 将抑制流体的湍动 , 以层流为主。一般划分 标准为 : 当 Re < 2000时 , 流体流型为层流 ; 当 2000 < Re < 4000时 , 流体流型受外界条件的影响 , 有时为层流 , 有时为湍流 ; 当 Re > 4000时 , 流体流型为湍流。

典型的微流控通道结构需要样品和试剂量在 100 nl 和 10μl 之间 , 甚至更少 ,微流控通道的直径 范围在几十到几百微米。根据 Re = duρΠμ可知 , 在 微流控通道中流体的流速越低 , 试剂的粘度越大 , 则流体的 Re 越小。基于微芯片上通道的尺寸特点 可以了解到流体在通道内均呈现层流特性。因此 , 当两种或更多不同试剂流同时流入同一通道 中 , 各试剂流能够同时保持自身的流型不变而只在相与相的接触界面上发生反应或分子扩散现象 ,并且具有较高的稳定性和重现性。大量的文献报道了 根据微型通道内的层流特点的应用研究工作。根据这一基本原理 , 多相层流微流控系统被广泛应用于众多领域。

3.微流控层流研究与应用

①层流界面之间的分子扩散、转移现象及应用

萃取是化学实验中一项最基本的操作之一 , 主要是体现在两个不同液相界面上的分子的扩散、转移。由于微芯片上的微型化通道具有较大的比表面积和较小的扩散距离等优点 , 微通道内的萃取操作 具有试剂消耗量极少、扩散时间短和分析速度快等 优势 ,从而实现在不用任何机械搅拌、混合、震荡的条件下完成高速高效的分离分析。还可以针对不同 的需求设计出不同的微通道模型 ,如单一的“H”型、 “Y”型、“T”型 ,以及复杂的网络型、二维通道、三维 通道等。在生命科学研究 ,尤其是在贵重试剂的制备和分析检测等方面具有广泛的应用前景。

目前 ,在这方面的研究已经取得了很大成功。 Yager 等根据两相界面间的分子、离子的扩散来研究 H + 的过滤[15 ]在微流控芯片上完成了 Ni2 + 从水溶液中向氯仿中的萃取 ;在多相层流微流控芯片上实 现无机相和有机相界面间 Co2 + 的分离分析等。 Tokeshi 等也利用微型注射泵有效地控制有机相和水相的流速从而保证在微通道中形成稳定的层流 , 将 Fe2 + 从水相中萃取到有机相中。在溶液中加入染色示踪试剂 ,根据染色剂流向可以观察到 Fe2 + 从水相萃取到有机相的全过程 ;通过变换实验条件 , 分别检测不同浓度的标准 Fe2 + 溶液 ,根据得到的数据作出标准曲线图 ,就可以进行定量的在线检测。 Zhao 等 利用层流技术结合逆流进样的方法实现了两种不溶相之间的萃取操作 ,该方法使两相界面之间接触更加充分 ,萃取更加完全。方群等在液-液萃取 ,微孔膜萃取和液-液萃取与气相色谱联用等方面的研究也都取得显著的成绩 ,实现了层流 分离对溶液中 K + 的提取和在线电化学检测。

随着这一基本操作的日趋成熟和完善 , 这种技术方法已经被进一步应用到有机合成反应的研究 , 尤其是贵重、难以制备的试剂间的反应 , 以及反应速率的控制与检测等众多领域。应用层流连续平行流的特点 , 通过有效地控制微型通道的长度来控制反应时间 , 使反应能够稳定进行并且尽量提高反应产率。层流分析技术将芯片分析与质谱分析或气相 色谱分析联用 ,大大节约了分析成本 ,已经初步实现了产业化。在生物医学方面也利用层流技术对脂肪层生物蛋白质进行了立体性选择分离和提纯等分析操作, 采用计算机模拟的方法根据复杂的微通道网络中的溶液与示踪染料的混合流向 , 计算分析得到了微芯片通道选择分析的最佳流体流向途径和最优化数据。

随着层流在萃取等方面的研究应用 , 其检测技术也有了进一步的发展提高。目前 , 在层流萃取分析方面应用了在线照相(photograph) 检测技术 , 能够准确直观地观测分析的整个过程。某文献报道了应用准弹性激光散射检测方法 ( quasi2elastic laser scattering ,QELS) 分析层流过程中水相Π有机相界面间金属鳌合物的萃取现象。在这种方法中不必用探测示踪原子或分子 , 检测简单准确, 可以适用于溶液的溶解、混合、萃取等研究领域。

②层流界面间的化学反应及其应用

由于层流一维流体的特点 , 在接触界面间可以保持自身稳定的流型不受破坏 , 如若控制流体的流 速则可以有效控制相界面间粒子扩散的程度。基于层流的这种特性可以在通道内实现试剂混合、聚合反应、催化反应、氧化还原反应、合成反应以及与之相关的反应速率控制 , 反应过程的在线观测和反应产物的进一步检测和应用等。

微通道内的双相或者多相层流体系可以实现试剂特别是贵重的或者难以制备的试样的混合 , 得到的混合溶液浓度和 pH 值等性质都具有很高的重现性和稳定性。这种方法尤其适用于生物科学和临床医学方面的研究 , 实现采样、试样预处理、化学反应 和分析检测一体化。微芯片分析本身对试剂消耗量 仅为纳升级 , 因此可以有效地节省在转移、分析和存贮过程中的试剂损耗。例 如 , Hosokawa 等设计出一种微型的试剂混合器 , 这种装置将 4 个疏水性微型毛细管和1个微通道连接在一起 , 通过调节毛细管中气体的压力 , 使得微通道中两相流体在气压的作用下混合完全 , 该体系尤其适用于微量和痕量分析。Manz 小组也根据微通道内平行层流的特点设计了一个微型试样混合器 , 这个芯片由玻璃Π硅片Π玻璃三层结构组成 , 其尺寸大小为 5 ×10 ×2 mm ,该微通道的内存容量仅为 600 nl。为了检验该微通道的试剂混合性能 ,将荧光素和罗丹 明作为两相待混合流体通过进样口的多组毛细管流入同一微通道内 , 可以观察到多组层流在通道内逐 渐混合为一体的过程 , 同时可以检测到整个试剂混合过程花费的时间仅仅为毫秒级。经过实验测定 ,这个微型混合器适用的流体流量范围非常广泛 , 1 —200 μlΠmin 的流体流量溶液都可以达到很好的混合。

在整个合成反应中 , 试样的混合、加热和冷却是一个关键的整体步骤。由于容器自身的特点 , 在容器中的反应经常是首先在局部发生 , 从而产生一些不必要的误差并且反应效率也会受到影响。微通道具有较高的比表面积 , 而且对温度的控制很容易实现 , 通过电热块加热控温可以形成较好的温度梯 度 , 有利于反应速率的控制。应用网络型微通道设计可以实现试样在线混合、检测以及反应的 控制等操作。多种试剂从不同进样口进入同一微通道内 , 在网络型微通道内实现试样的充分混合 , 使反应进行完全。

应用层流间两相的聚合反应在微通道内形成聚合物薄膜 , 将微通道分为两个独立通道 , 通过这层 聚合物薄膜可以实现不同流相中粒子的选择分离提 取 , 这也是层流分析的重要应用之一。Hisamoto 等 就曾经提出由于微通道具有较大的比表面积 , 可以通过有机相Π水相两层流 , 有机相Π水相Π有机相 三层流界面间的聚合反应 , 在通道内部形成平行的尼龙聚合物薄膜结构(如图 1 所示) , 并且应用这种通道内薄膜实现了 NH+ 4 的渗透分离和聚合物薄膜的表面酶化。Peterson 等也报道了相似的在微通道内形成聚合物薄膜的加工方法。Kitamori等利用层流技术实现了在直径250μm的微通道内水相 和有机相之间的化学合成反应。3 , 52二硝基氯苯作为有机相 ,和水相中的 DL212苯乙胺发生化学反应 , 该实验表明层流界面之间的比表面积很大 , 使反应物之间可以充分接触 , 因此与传统实验装置相比较在微通道内进行的一些反应的产率较高。

图 1 在 X型微通道内有机相Π水相界面间发生化学反应形成聚合物薄膜

另外 , 由于聚合物薄膜本身具有弹性 , 可以通过这种薄膜的平行稳定特性来控制通入通道内的液 体或气体的流速或流量 , 以保证液Π液 , 液Π气相对 稳定的流速和流量比率 ;还可用生化酶实现尼龙薄 膜的表面改性 , 使聚合物薄膜具有选择性渗透、吸附的作用。根据这种层流反应可以在通道内形成多层平行的聚合物薄膜 , 用不同种类的生化酶分别对通道内形成的这种平行多层薄膜进行表面改性修饰 , 就可以实现多相平行分析检测。根据同样的原理 , 将催化剂有效沉积在薄膜的表面 , 可增大催化材料的比表面积 , 从而加快通道内相匹配的催化反应的速率。

利用层流界面之间的氧化还原反应 , 将金属丝沉积在微芯片通道内 , 可以用作电极 , 将电化学检测系统建立在微芯片上 , 实现微芯片上电化学检测 与分离分析的集成化 , 应用在微反应器、微型传感器中。Kenis 等利用微通道界面间的还原反应将 金属 Ag 还原沉积到通道表面 , 形成一条精细的金 属线。用作 Ag 电极 , 有利于芯片的集成化。利用相同的原理可将其它金属与芯片结合 , 加工制作成微反应器或微型传感器的敏感元件。这种加工方法对试剂的消耗量极少 , 因此更有利于一些贵重的稀有金属如钯、铂等在微流控体系中的制备与加工。

③层流在制备纳米材料方面的应用

随着纳米材料科学的快速发展 ,许多制作纳米材料的方法已经被开发出来, 如固定的沸石微反应器和多孔硅质微反应体系等。但是这些加工方法本身的生产成本较高 , 难以得到普及应用。目前 , 某文献报道了根据微通道内多相层流现象 , 即在不同相界面间发生反应和分子扩散这一特点 , 实现了通过控制反应流体的流速和粘滞力的大小控制反应产物颗粒的大小。Kenis 等提出使 NaHCO3 、CaCl2 和 KH2PO4三种溶液平行通入微通道内发生反应生成 CaCO3 颗粒沉淀 , 如图 2 所示。这个实验说明了层流反应形成微小颗粒的可行性。同 时 , 通过有效合理地控制流体的流速以控制在相界面上发生连续反应的速度 , 可以间接调节控制生成的沉淀颗粒大小 , 为纳米材料的制备开拓了一个新的局面。Wang 等 利用层流反应生成的二氧化钛沉淀颗粒就达到纳米级 ,甚至小于 10nm。应用这种方法反应生成催化剂微型颗粒并且将其有效地沉积在通道内表面 , 可以用来实现通道内的催化反应。 如图 3 所示 , 利用层流反应和溶胶2凝胶过程在微通道内壁固定一层纳米级生化酶 , 从而形成一个生化酶固化微通道反应器 , 具有广泛的应用 。除此之外 , 一些贵重金属催化剂和有机催化剂也可以通 过这种方法制备到微型反应器中 , 从而加速并控制通道内反应的反应速率。这种方法同样也适用于生 物大分子和蛋白质分子形态的控制 , 例如应用层流定位观察控制神经细胞的生长过程。

图 2 在微通道内由 NaHCO3 , CaCl2 和 KH2 PO4 三相流体形成的两层界面之间发生沉淀反应形成方解石和磷灰石颗粒的过程

④微流控层流刻蚀加工技术

多相层流微流控体系也发展并完善了微芯片的加工技术。普遍被应用的微芯片的加工技术是光蚀刻和软蚀刻两种 , 但是这两种方法的精密度较低、 制作工序复杂 , 而层流蚀刻的发展则有效补充了前两种制作方法的这些不足。如微型 印刷术 (microprint) 、在毛细管内的微型模板技术和可复制模板技术等 ,比传统的加工方法更加简便易行 , 不 必经过复杂的封合步骤 , 并且有利于实现复杂的多维通道模型的加工制作 , 从而有效地提高了芯片的集成度。最值得一提的是它可以在密封的毛细管通道内进一步刻蚀加工 ,提高了微芯片通道的复杂化 程度。它不仅可以应用于玻璃芯片 (通过 KF 溶液 和 HCl 溶液的层流反应蚀刻得到) , 而且可以应用于聚二甲基硅烷 (polydimethylsiloxane , PDMS) 材料上 , 而这种材料更适合于生物医学和药物分析方面的研究。Chen 等  应用层流技术在线得到不同浓度的光刻胶溶液 ,同时将光刻胶涂覆在 PDMS 浇注得到的三维微通道内作为光刻掩膜 ,然后用紫外光照射。由于通道表面涂覆的光刻胶具有一定浓度梯度 ,显影后得到的微通道也具有一定的大小梯度 ,继而得到不同深宽比的微通道 ,可将其应用于生物细胞分析领域。

在应用微流控毛细管电泳技术分析研究细胞过程中 , 细胞的进样、沉积以及溶膜过程是研究的热门课题。由于细胞本身多带有电荷 ,因此一般采用夹流进样的方法 , 通过控制电流的方向和大小 ,从而使得细胞贴壁沉积 , 然后溶膜。这种技术方法要 实验技术较高并且电渗流会影响分析的过程和结果。而应用层流刻蚀的方法加工制作微芯片 , 使得通道内部可以提供与细胞尺寸相当的定位点 , 从而有效控制细胞 ,实现对细胞的进一步分析检测。 如图4所示 ,采用层流刻蚀技术 ,通过控制流体的流量大小 ,按照微通道加工需要 ,调节蚀刻剂和非蚀刻 剂流量比率 ,就可以在通道内蚀刻出细胞大小的凹槽等需要的通道形式 , 以便于细胞的沉积和分析等。

目前 , 层流刻蚀形成的芯片已经被广泛应用于生物医学分析和药物合成领域 , 加快了化学生物分析技术的发展。层流刻蚀通过控制流速和流体粘度 来控制通道的内径与细胞生物大分子的大小相适应 , 从而实现对其的分离分析和定位分析等。

⑤微流控层流在生命医学方面的应用

微通道内的多相层流扩散分离技术也逐渐在生命医学方面的研究中得到广泛应用。两相或多相流体形成的界面可以根据粒子如离子、蛋白质和细胞等的大小进行选择扩散。小粒子可以通过界面扩散到相邻相中而留下大粒子 ,从而达到不同 粒子的分离分析 , 可应用于人血液中血清白蛋白的测定 ,血液 pH 的测定 ,血液中 K + 的测定 ,细胞内物质的提取、分离与检测 , 以及蛋白质的净化等。

图4层流刻蚀加工的结构举例 :a、b) 通过从进样通道调 节流体的流速形成不同尺寸的微通道 ;c) 在微通道内定位 蚀刻 ;d) 7 个进样流体层流蚀刻而获得的复杂结构 ;e) 同时控制刻蚀液的流速和通过时间而获得的多层次结构

根据细胞或蛋白质的大小不同 ,层流技术可以实现生物试样预处理和分离提纯等。例如传统捕获 精子的方法是难以操作和控制的 , 而应用多相层流技术将试剂中的活精子和死精子以及其他大分子残 骸分离的方法 ,既简单又容易操作控制 , 实现了试样的预处理提纯 , 提高了在线检测的分析效率。这种技术设计填补了临床上针对极少量精液试剂的分析设置。而且由于其小巧简单 ,因此也同样适用于家庭化检测。Jandik 等根据生物分子的重量不同 ,在“H”型微通道内实现了抗生素的预处理工作 , 完全避免了使用离心分离机或者其它通用方法的不利影响。

一般生物分析中所选用的试样量都是极其微量的 , 采用传统的分析测定方法有较大的难度和不便 , 而采用微流控系统控制解决小体积贵重试剂的混合和稀释 ,比传统的溶液混合稀释方法要操作简单易行而且分析效率也较高。Jiang 等提出了一个微型稀释网络通道设计 (microchannels microdilutor networks , μDN) , 在微通道内实现对生物抗体和抗原试样的预处理 , 应用微流控通道网络实现溶液的连续性稀释 ,从而得到一系列不同浓度的溶液 , 并 在同一芯片上实现艾滋病毒 (HIV) 的在线分析检测操作。最近 ,Whitesides 等 利用同样的层流分析原理 ,采用螺丝作为阀门 ,控制流体流向 ,实现了芯片微通道内生物免疫分析 , 成功地实现了对人体内血清 IgA 和 IgG值的分析测定。相信这种方法将在临床医学、环境科学和生物化学领域有着广泛应用前 景。另外 , 也有文献提出网络型微芯片通道的分析过程 , 即通过研究控制流体的流速 , 在通道内以层流的方法将溶液混合稀释而形成固定的浓度梯度特征。因此可以形成一系列具有固定浓度梯度的溶 液 ,以用于分析检测和标准曲线的绘制。

另外 ,根据微通道内流体的层流特性可以实现 对一些生物反应的在线检测。一些生物反应如细胞体的特性检测都是在极短的时间内进行完全 ,而且 细胞分子体积小 ,难以控制 ,若选用常规方法观察分 析是难以完成的。微通道内层流具有较高的流体稳 定性和重现性 ,因此更加便于芯片内细胞反应的观察研究 ,实现“定位分析”。Takayama 等 在 PDMS和玻璃的混合芯片的微米级通道内 ,通过控制进样压力实现了在 3 个微通道汇合处对单一细胞的分析检测 ,并且在微通道内实现了细胞沉积和酶催化。该实验论证了不同蛋白质和细胞的表面型 态 ,并且解释了酶对细胞或细胞内蛋白质的选择反 应。Yamada 等在 37 —96μm 的微通道内利用两相层流技术实现了大细胞的萃取分离分析。实验表 明 ,当微通道的内径进一步减小 ,分离效率也会有很大的提高。

3.微流控层流发展的方向

目前微流控多相层流技术已经取得了有目共睹的成就。我们相信微流控多相层流技术将会发展得更加成熟 ,其发展前景具体体现在以下几个方面 :

(1)在微流控芯片加工技术方面来看 ,充分应用计算模拟技术设计微芯片模型 ,使得层流不再只是适合于简单 的“T”型、“Y”型通道。考虑到微芯片通道与传统分析反应器的区别 ,加强对通道的模型、尺寸以及深宽比的理论研究和对芯片通道内壁的涂覆和化学修饰的研究应用 ,从而有效提高微芯片通道内的反应稳 定性 ,提高分析分离的灵敏度 ,延长芯片的使用寿命。另外 ,在加工材料的选择方面 ,不仅仅是应用光学玻璃 ,更应扩展对其它材料的尝试和使用。目前有机聚 合物材料如PDMS、聚甲基丙烯酸甲酯 (polymethyl methacrylate , PMMA) 和有机玻璃等的广泛使用 ,弥补了玻璃作为通道载体的加工过程繁琐 复杂、通道深宽比难以控制等不足。（汶颢股份提供PDMS芯片、PMMA芯片、玻璃芯片、纸芯片等材质微流控芯片）

(2)在应用的范围上来看 ,目前层流技术还只是应用在两相或者三相的分析反应上 ,层流技术在多相平行分析方面的应用还有待于进一步提高。这就对微芯片通道的加工设计提出了新的要求。层流技 术的应用将不会只是局限于二维通道 ,而是会被广泛应用于PDMS等材料制备的三维芯片上。相信立体化、多样化的微芯片通道将会更加成熟地发展下去 ,也将为扩展多相层流的应用提供必要的条件。

(3) 微芯片的集成化更是目前和将来研究的重点。芯片通道的微型化有着优于传统分析仪器的一 些特点 ,但是由于微芯片耗试剂量极小 ,因此仍然存在着采集、进样和检测等系统和芯片难以匹配的现象。这也是要尽快解决的问题 ,否则微芯片的应用发展同样会受到这些因素的影响限制。Du 等 成功地将流动注射自动进样系统与微芯片通道联系起来 ,实现了进样与分析的一体化。该体系能够实现 10000 Πh 进样分析 ,为微芯片的广泛应用打开了一个新的局面。在微芯片上实现采集、进样、分析和检测的集成化是微芯片研究的一个关键所在 ,也是微芯片走向工业化应用的基础。

(4) 当前微流控分析的重要研究方向包括细胞生物学应用 ,免疫及分子诊断、临床分析应用和纳流控分析等 , 强调对单细胞分析的采样、定位、溶膜等过程的操控。层流作为其中的一种加工和分析手段 将具有广泛的应用前景 ,它将被普遍应用于分离分析、合成反应、材料制备、模型加工、临床医学和生物化学等众多领域。（原标题：微流控层流技术的研究 文章来源：浙江大学化学系 微分析系统研究所 文章编号 : 10052281X(2006) 07/8-0966-08）