基于尼龙微孔薄膜的微流控芯片的制作及对葡萄糖的显色响应
近年来,人们在纸质芯片的制作和应用研究中发现，纸质芯片由于机械强度低,在操作过程中容易造成对基质材料本身和芯片图形的损坏,使得其应用受到了限制。因此,寻找新的基质材料并制作出具有较高应用价值的薄膜芯片尤为必要.本文对一系列薄膜基质材料进行了筛选,并对制作工艺进行了改进,制作了一种基于尼龙微孔薄膜的芯片。进一步将葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶固定在该薄膜芯片上,利用酶促化学反应对葡萄糖样品进行了研究,并通过颜色变化对不同浓度的葡萄糖进行显色分析。研究结果表明,这种新型尼龙微孔薄膜芯片具有实际应用价值。
1实验部分
1试剂与仪器
乙醇和氢氧化钠(分析纯);碘化钾(分析纯)、葡萄糖(分析纯)、葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase,GOD)和辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)。
聚醚砜树脂滤膜(PES,孔径0-22滋m)、聚偏氟乙烯滤膜(PVDF,孔径0-22滋m)、聚四氟乙烯滤膜(PTFE,孔径0-45滋m)、醋酸纤维素滤膜(CA,孔径0-22滋m)、混合纤维树脂滤膜(水膜,孔径0-22滋m)和尼龙滤膜(Nylon,聚己二酸己二胺,孔径0-45滋m)的厚度均为100滋m。SC-B型匀胶台；GP18正型紫外光刻胶；URE-2000/35型深紫外光刻机;CT-946型电热板；PDC-MG等离子体清洗器。
2实验过程
2.1尼龙薄膜微孔微流控芯片的制作
芯片的制作过程如图1所示.首先将厚度为100滋m左右的尼龙微孔薄膜浸润到紫外光刻胶中2~3min,待微孔薄膜被光胶充分浸润后,取出薄膜并滴沥多余的光胶,常温下放置5~10min,使光胶初步固化,再将此薄膜放置在电热板上于80益烘烤15min,以形成坚硬的薄膜光胶层。采用高分辨激光打印在黑白胶片上制作用于设定的通道形状的掩膜。将掩膜覆盖在光胶层上进行紫外光刻,10min后光刻结束,将曝光过的紫外光胶用7-0g/L的氢氧化钠溶液进行清洗,形成目标通道图形。然后将薄膜芯片用去离子水清洗,使其处于中性的pH值环境.再将此薄膜芯片置于电热板上于80益烘干10min,制得干燥的薄膜芯片,然后用等离子体处理1min,以增强其亲水性,即制得所需的尼龙微孔薄膜微流控芯片.
2.2葡萄糖的检测
将葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的混合溶液(浓度均为30U/mL)滴加在薄膜微芯片的圆形反应检测区域(图1中的3个外围圆形区域),待其干燥后在相同的位置滴加相同体积的0-6mol/L碘化钾溶液,在空气中自然挥干后待用.
Fig.1Fabricationprocessofmembrane-basedmicrofluidicchip
将不同浓度的葡萄糖样品溶液滴加在芯片的进样位置(图1中的中心圆形区域),该溶液通过沿通道的自由扩散可到达芯片的反应检测区域.。10min后反应结束,通过反应产物颜色的响应变化来实现对不同浓度的葡萄糖的检测分析。将反应显色完全的的芯片拍照后,采用Photoshop图形软件将所获电子图片转化为8位(bit)的灰度图片,在灰度图片上选取反应显色区域,利用Photoshop软件读取这一区域所有像素点的灰度强度平均值,然后减去空白区域像素点的灰度强度,即得真实颜色的强度改变值。基于此,根据葡萄糖浓度对颜色强度值进行线性拟合即可实现对葡萄糖样品的定量检测[23].
2结果与讨论
1薄膜芯片的制作
1.1薄膜材料的选择
选取了一系列薄膜基质材料用于薄膜微流控芯片的制作。由于正性紫外光胶具有一定的溶解能力,所以要求所选的薄膜材料能够在光刻胶中稳定存在。通过对混合纤维素酯膜、聚四氟乙烯膜和尼龙膜等多种薄膜研究比较后发现,紫外光刻正胶能很好地浸润混合纤维素酯膜,但长时间的浸润会导致该薄膜变形、溶解,因此不适于芯片的制作。聚四氟乙烯膜因具有较好的机械强度而被认为是一种理想的芯片制作材料,但研究发现由于紫外光刻正胶具有一定的亲水性,而聚四氟乙烯膜却具有极强的疏水性,因此导致光刻正胶无法在四氟乙烯膜表面均匀分布并形成厚度均一的薄膜层,故聚四氟乙烯膜也无法用于薄膜芯片的制作。相比之下,尼龙薄膜的亲疏水性质与光刻正胶具有良好的兼容性,可以在其表面形成厚度均一的光胶薄膜,且内部微孔也能得到充分的浸润.此外,尼龙薄膜由于自身的材料属性而能在光刻胶中稳定存在,因此它是一种理想的制作薄膜芯片的基质材料。
1.2芯片通道宽度的选择
由于薄膜芯片具有微孔的性质,液体在通道中的流动可以不依靠附加的驱动装置而通过毛细扩散来完成,所以液体在不同宽度的通道中会具有不同的浸润速度,而且不同宽度的光胶隔离带对液体的阻挡作用也不同。我们在直径为50mm的尼龙微孔滤膜上加工了一系列具有不同宽度的微通道和光胶隔离带(见图2),考察了液体在不同宽度的微通道中的浸润能力和光胶隔离带对液体的阻挡作用.结果表明,微通道越窄,液体在通道中的浸润速度越慢且浸润距离越短,反之则浸润速度越快且浸润距离越长。当微通道采用等离子体处理后,虽然其亲水性得到增强,但仍然存在着相同的浸润趋势。
Fig.2Fabricatedmicrochannels(unitinmicrometers)(A)andbarriers(B)withvariedwidths(unitinmicrometers)
实验中还发现,当微通道宽度大于400滋m时,液体就可以保持稳定的速度浸润整个通道;另外,形成的光胶隔离带越窄,对液体的阻挡作用越弱.因此,为引导液体能够按照既定的流路流动,光胶隔离带必须具有足够的宽度以实现对液体的阻挡,并防止液体扩散的发生。进一步的实验结果表明,当光胶隔离带宽度达到240滋m时即可起到有效的阻挡作用;当其小于240滋m时,随着光胶隔离带宽度的减小,液体渗过光胶隔离带的速度变得更快。对光胶隔离带和微通道的进一步优化后发现,所制作的尼龙薄膜芯片不仅通道规则、边缘光滑,还具有较高的分辨率,并可对流体实现更准确控制.
2.1.3其它影响因素的考察
在尼龙薄膜芯片的制作过程中发现,所形成的光胶层的厚度对流体在芯片通道中的浸润性具有显著影响.这是由于紫外光刻产生的芯片通道的深度有一定的限制,因此当光胶层较厚时,紫外光将无法完全穿透整个光胶层,所刻蚀的通道会因光胶的残存而对液体的浸润具有明显的阻碍作用;而当光胶层较薄时,目标通道周围由于缺乏对光胶的有效阻拦,导致在芯片中流动的液体渗透到通道以外的其它区域.可见,控制薄膜光胶层的厚度对流体在通道中的浸润具有关键的作用。在芯片的实际制作过程中,将尼龙薄膜用光胶充分浸润后置于匀胶台上,通过调节匀胶的转速来控制光胶的厚度,转速越高、转动时间越长,所得到的薄膜光胶层厚度越薄,反之则越厚。实验结果表明,选择转速为300r/min,转动时间为20s时,可在尼龙薄膜上获得厚度为150滋m的最适光胶层。
由于该尼龙薄膜芯片将主要用于对取自生物和环境等领域样品的检测,而所涉及的样品大多具有亲水性,因此增强芯片通道的亲水性尤为必要.在得到干燥、规则的尼龙薄膜芯片后,进一步对尼龙薄膜芯片通道采用等离子体处理2min,使液体在芯片通道中的浸润性和浸润速度明显增强.
2.2葡萄糖的检测
如图3(A)所示,在外围3个圆形区域中分别滴加1滋L葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)的混合溶液(体积比5颐1,酶浓度均为30U/mL),待其在常温下自然挥干后,继续滴加1滋L0郾6mol/L的碘化钾溶液,再在常温下自然挥干.然后,在中心圆形区域中滴加待测葡萄糖样品溶液1滋L,待反应10min结束后,即可对其进行显色响应分析
检测机理:含有葡萄糖的样品溶液通过尼龙薄膜微孔的毛细扩散作用到达检测区域;葡萄糖在GOD的酶促催化作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢[反应式(1)],所产生的过氧化氢在HRP的催化下会进一步与碘化钾反应生成水和碘单质[反应式(2)];通过对碘单质颜色深浅的观察即可判断样品中葡萄糖的含量。
实验中发现,此尼龙薄膜芯片上外围圆形检测区域面积的大小对样品中葡萄糖的检测灵敏度影响明显。外围圆形区域面积越大,所生成的碘单质越分散,颜色越浅;反之,所生成的碘单质则越集中,颜色越深,检测灵敏度越高.因此,在综合考虑浸润速度和反应区域的面积对葡萄糖检测灵敏度的影响后,最终选择尼龙薄膜芯片的通道宽度为1mm,外围圆形反应区域的直径为3郾5mm.
Fig.3Schematicpatternsofmicrochannelsusedforglucoseassays(A),blankexperiment(B)andthechangedcolorofiodinewith10郾0mmol/L(C),25郾0mmol/L(D),50郾0mmol/L(E)ofglucose
对一系列不同浓度的葡糖糖样品溶液进行了显色响应研究,发现碘单质颜色的深浅对样品中的葡萄糖浓度的高低具有明显响应.样品中葡萄糖的浓度越高,所生成的碘单质颜色越深[图3(E)];而浓度越低则颜色越浅[图3(C)];与空白实验[图3(B)]相比,最浅颜色所对应的葡糖糖的浓度为10-0mmol/L.
研究发现,葡萄糖样品溶液的滴加速度也会对显色响应反应产生较大的影响.滴加速度过慢会导致待测溶液难于到达检测区域,因此会延长显色响应反应的时间;而滴加速度过快则易导致试样溢出通道区域。实验选择的葡萄糖样品溶液的滴加速度为2滋L/min,既可达到预期的实验设计效果,又可使显色响应反应在10min内完成。
为验证方法的重复性及稳定性,在不同的尼龙薄膜芯片上进行了平行实验.在图3(A)所示的芯片上,对特定浓度的葡萄糖进行分析检测,1次操作就可获得3个平行检测结果;而进一步进行3次平行检测操作,就能获得9个平行检测的结果.然后对这9个结果所产生的颜色强度进行灰度值分析,用获得的相应数据来考察此检测方法的重复性.对浓度为25-0mmol/L的葡萄糖溶液进行了3次平行分析,9个测定结果的平均偏差为2-0%,标准偏差为3郾0%.以上结果表明,该方法稳定可靠,可对样品中的葡萄糖浓度水平进行准确有效的颜色响应.
显色区域的图片经过处理后可得到其灰度强度值,对灰度强度值与葡萄糖浓度之间的关系进行了研究.结果表明,灰度强度值随着葡萄糖浓度的增大而上升,但浓度越大,强度变化幅度越小并趋于平缓[图4(A)].值得一提的是,虽然检测区域内的颜色深浅与碘单质的分散程度有关,但采用Photoshop软件读取像素灰度平均值时,是对整个圆形反应区域进行读取,然后求其平均值,因此不太均一分布的碘单质颜色不会对最终的计算结果造成影响.在0~30郾0mmol/L范围内对碘单质的颜色灰度强度鄄葡萄糖浓度之间的关系进行了线性拟合,其线性方程为
式中,y为碘单质的颜色灰度强度值,x为葡萄糖溶液的浓度(mmol/L).该方法对葡萄糖的最低检测浓度为5mmol/L.将此法用于健康人尿液中葡萄糖的含量检测,结果如图4(B)所示.当在健康人的尿液中添加浓度为10郾0mmol/L的葡萄糖溶液时,以碘单质的颜色灰度强度所测得的实际葡萄糖的浓度为(10郾0依0郾4)mmol/L.结果表明,该方法可满足定量分析实际样品中葡萄糖的要求.
Fig.4Plotofmeanintensityasafunctionofglucoseconcentration(A)andthechangedcolorofiodinefromurineassay(B)
3结论
以尼龙微孔薄膜为基质材料,采用光刻法制作了一种新型薄膜微流控芯片。通过对制作工艺进行优化和改进,使薄膜芯片的制作步骤及周期大为简化和缩短。在该芯片上固定葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶后,利用二步酶促化学反应实现了对不同浓度葡萄糖的显色响应。结果表明,所制作的尼龙薄膜微流控芯片具有良好的重复性和稳定性,可用于实际生物样品中葡萄糖的检测。
文献来源高等学校化学学报doi:10.7503/cjcu20120349作者：杨俊，齐莉，马会民，陈义（转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）