基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术简述

资料来源：遗传, 2019, 41(7): 611-624 doi: 10.16288/j.yczz.19-051

病原微生物的快速检测对疫情的预防控制至关重要。近年来,微流控技术与核酸等温扩增技术相结合,诞生了多种病原微生物等温扩增微流控检测技术。该技术实现了病原微生物核酸提取、扩增与检测一体化,并具备多重检测、定量检测等功能,具有对仪器依赖度小、对操作人员要求不高、样本量需求小和自动化程度高等优点,适合于在多种环境下的病原微生物快速检测。本文将对目前基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术进行简述，以期为病原微生物的快速筛查提供更多的方案思路。

一、基于重组酶聚合酶扩增的病原微生物微流控检测技术

2006年,Piepenburg等首次提出了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification, RPA)。它是由重组酶(T4 uvsX)、聚合酶(Bsu)和单链结合蛋白(gp32)以及两条特异性的上下游引物参与的等温扩增。首先,T4 uvsX在辅助因子uvsY的作用下与引物结合形成核酸蛋白复合物,然后该复合物寻找与靶标DNA的互补区域进行杂交并置换下另一条单链,置换下的单链马上被gp32结合防止其再与互补链杂交,最后T4 uvsX在ATP的作用下与引物解离,聚合酶Bsu与引物结合并沿模板进行延伸(图1)。该反应在37~42℃下30 min内可以获得10的12次方拷贝的扩增产物,其灵敏度可达到单拷贝,其扩增产物长度在500 bp以内最佳。对RPA产物的检测可采用包括琼脂糖凝胶电泳、荧光探针实时检测、及侧流层析检测等多种方法。由于RPA反应快速、灵敏以及恒温条件温和等特点,因此易于与微流控芯片结合开发出对病原微生物的即时检测(point-of-care testing, POCT)技术。

图1   重组酶聚合酶扩增反应基本原理

1：在重组酶作用下,引物与靶序列结合;2：引物与靶序列结合后置换下的单链被单链结合蛋白结合;3：在聚合酶作用下进行延伸,同时置换下的单链被单链结合蛋白结合;4：同源双链分离,持续延伸;5：形成新的双链,并进行下一个循环。参考文献[10]修改绘制。

二、基于环介导等温扩增的病原微生物微流控检测技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)由Notomi等于2000年首次发表,该反应原理如图2所示。针对待测靶标设计一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP,在具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)作用下,引物沿模板发生延伸和链置换反应,产生长短不一的靶标重复片段,该反应通常在60~65℃进行,1 h内将待测靶标扩增109倍以上,灵敏度可达到检测10拷贝的待测靶标。通过额外引入一对环状引物可显著提升其检测灵敏度并使反应时间缩短至30 min内。其扩增产物可通过凝胶电泳、双链嵌合染料、比浊法、钙黄绿素、羟基萘酚蓝、pH响应显色、纳米金可视化]等方法进行检测。鉴于LAMP灵敏度高、检测方式多样、反应速度快等优点,近年来发展了很多LAMP微流控芯片,它们在进样方式、产物检测方法等方面各有千秋,在病原微生物核酸检测方面均具有较好的应用前景。

图2   环介导等温扩增原理

A：LAMP外引物F3/B3和内引物FIP/BIP与靶标互补的6个区域,如其中F3与F3c互补,B3与B3c互补;B：起始结构产物生成步骤,引物FIP通过F2区域与模板链F2c结合并进行延伸,之后F3与靶标F3c结合并进行链置换反应,FIP延伸产物被替换释放,释放的单链末端形成环结构(结构3)。BIP和B3以相似的方式进行,生成两端具有环结构的产物5。C：循环放大步骤,结构5以自身为模板,从3°末端F1区域开始自引发DNA合成,同时FIP退火至环状结构中的F2c区域并进行延伸得到结构6。结构6以自身为模板延伸,置换下与结构5互补的产物7。结构7到结构8再到结构5与结构5到结构6再到结构7类似。结构9和结构10分别由结构6和结构8生成。在环状结构与FIP/BIP引物的共同作用下生成含有多个重复靶标序列的结构11、12。

三、基于其他核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术

1、基于其他核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术

滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)是一种具有链置换活性DNA聚合酶催化的等温扩增反应,需要一条锁式探针与靶序列杂交后连接成环状模板,引物与环状模板匹配后在DNA聚合酶作用下沿环延伸并不断置换先前产生的延伸链,最终产生重复的长单链DNA产物。

2、基于依赖核酸序列扩增的病原微生物微流控检测技术

1991年,加拿大Cangene Corporation公司Jean Compton实验室首次提出依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)。该方法以单链RNA为模板,在恒温条件下,通过逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物来模拟体内逆转录病毒的复制机制对目标RNA进行扩增],90min内可以将靶标扩增至10的12次方,其产物长度为100~250 bp,灵敏度可达检测单个拷贝的靶标分子。

3、基于解旋酶依赖性扩增的病原微生物微流控检测技术

在体内,DNA通过解旋酶、DNA聚合酶及各种辅助蛋白因子进行复制,Vincent等[49]模仿这一过程开发出了体外解旋酶依赖性扩增法(helicase-dependent amplification, HDA)。该方法原理是首先DNA双链被DNA解旋酶(E. coli UvrD helicase)分离为单链并分别被单链结合蛋白(single strand DNA-binding protein, SSB)结合,之后两条上下游特异性引物分别与模板杂交,在DNA聚合酶(exo- Klenow)的作用下延伸,合成新的双链,在37℃条件下反应1~2 h可获得106倍的扩增产物,其靶序列在400 bp范围内可以得到有效扩增。

四、不同技术比较

核酸等温扩增技术因其反应条件温和而倍受病原微生物检测的青睐。虽然各种核酸等温扩增技术在反应体系组成、反应条件、检测方式等方面均各有优劣(表1),但它们依然离不开核酸提取、扩增与产物分析等步骤,如何简化与集成这些繁琐操作步骤成为病原微生物核酸现场快速检测的关键。微流控芯片与核酸等温扩增技术的结合成功解决了这一问题。

表1   不同核酸等温扩增技术比较

相信随着微流控技术与核酸等温扩增检测技术的发展,会出现定量性能更好、仪器依赖度更低、可分析未知病原微生物序列的核酸等温扩增病原微生物检测芯片技术,使病原微生物即时检测向着集成化、快速、高通量、多重筛查的方向发展。

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