【文献】只需1美分，微流控诊断芯片带回家！

分享一篇2017年2月的PNAS，来自斯坦福大学医学院的工作，超低成本的稀有细胞分离富集微流控芯片，充满了工程学的解决问题思路，我觉得是很出色的工作。

稀有细胞（rare cells）是指含量<100个细胞/毫升全血的细胞，这些细胞在血液和组织中含量非常少，例如干细胞、循环内皮细胞、循环肿瘤细胞核残留病变细胞。分离检测稀有细胞对于重大疾病的早期诊断有非常重要的作用，例如疟疾、肺结核、艾滋病和癌症，这些致命疾病如果能通过对稀有细胞的分析完成早期诊断，控制病情乃至治愈的可能性将大大提高，减少病患痛苦，减轻医疗负担。

要实现这一目的，就要求从复杂的血液体系中快速准确地分离出我们想要检测的少量目的细胞并进行分类处理、纯化或富集。目前常用的实验室分析通常需要对目的细胞进行标记，引入外来标记分子以增强检出敏感度，但是这种手段可能会使得后续纯化步骤非常复杂，而且标记物有可能影响细胞原有性质。非常复杂，耗时耗力，花费也很高。

近些年非常热门的芯片实验室（lab on a chip, LOC）概念或许能解决这一困难。LOC指的是将一系列实验室操作集成到一个非常小的芯片上，只需极少量（微升甚至纳升级别）液体样品，就可以在生物芯片上自动完成操控分析。在许许多多的实验室分析技术当中，电动力学相关的技术尤其适合在芯片上实现，因为电场的方向、频率、振幅等参数都很容易精确控制，而且电泳、电渗、渗透电泳、毛细渗透等原理在生化分析方面有非常广泛而重要的应用。利用各向异性电场诱导受试样品（血细胞、肿瘤细胞、血小板、蛋白质、DNA分子等等）产生电偶极矩，就可以将不同性质的生物样品分离开，而且通过操控电场实现的生物样品分析不需要引入外来标记物，避免了标记可能带来的问题。

LOC技术具有的快速、准确、无外来标记物等特点使其非常适合与即时检测（point of care testing, POC testing）相结合，然而目前仍少有这方面的研究报道。即时检测，又称床边检测，顾名思义指的是就近、简便、迅速的检测手段。能够短时间在患者身边进行简单的检查和诊断，有利于医生和护士进行迅速处理。患者也可以在家自行使用POC设备，就可以方便对慢性疾病的持续性检查。而在医疗条件仍比较落后的发展中国家和地区，POC检测对于上文提到的疟疾、HIV、肿瘤等致命疾病的早期诊断具有非常重要的作用，而尽早诊断并介入治疗可有效提高病患存活率并降低医疗支出，因此开发低成本的POC检测设备对于发展中国家和地区医疗具有重要意义，这也正是这一工作的研究目标。

这一工作的主要内容是将LOC技术应用于POC检测，制造超低成本、一次性可抛弃的生物芯片，用于稀有细胞的分离与富集，以发展快速、便捷、廉价的重大疾病早期检测方案。

这一工作设计的微流控纳米喷墨电子检测平台为多层堆叠结构，下层是具有微孔结构的PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯，polyethylene terephthalate）柔性高分子薄膜，表面由可导电纳米粒子喷印形成电路结构；上层是PDMS（聚二甲基硅氧烷，polydimethylsiloxane）微流控芯片；中间层是绝缘薄膜，用于分隔开微流控芯片和电路结构，图1所示即为平台装置示意图。喷墨打印的分辨率可达20微米，整个平台设备成本只需1美分，约20min即可制作完成。

图1. 微流控纳米喷墨电子检测平台设计示意图 A)用喷墨打印机将含导电纳米颗粒的“墨水”喷印在PET底物薄膜上形成电路；B）1. PET柔性电路板；2. 粘附在绝缘膜上的PDMS微流控芯片

在这一平台中，绝缘层和微流控芯片为一次性使用后即可抛弃的，而PET柔性电路板可回收并重复使用，同时开发者可以通过开源软件自主设计电路，使这个平台拥有非常高的扩展性，可实现各类检测目标，图2为实物图。这种使用微流控芯片的检测方式不需要任何标记物，即可实现高通量检测。 

图2. D)检测平台实物图 F) PET柔性电路板实物图

为了验证喷墨微流控测试平台的作用，将不同尺寸（直径5微米和10微米）的PS（聚苯乙烯，polystyrene）微球表面包覆上链霉亲和素，制成PMS微球以模拟细胞，这种微球的大小和形状都与细胞相类似，同时实验还用到了酵母细胞和乳腺癌肿瘤细胞株（MDA-MB-231），以检验该平台在含有多种细胞的非均相体系中的作用。

通过微流控芯片设计以及柔性电路板可控电场的作用，这一装置可以实现的功能有：

（1）从多元体系中限制住单个生物粒子

如图3.A所示为平台示意图，底下三条横杠是PET柔性电路板上的电极，上面一块半透明的即为PDMS微流控芯片，中央是一道微流控管道。在低电场强度的条件下，微流控管道中间将形成电势阱（图3.B 电势分布曲线中间最低点），如果没有外来施加的能量，生物粒子无法偏离电势最低处。从图3.C的微流控芯片三维电势图可以清楚看到，芯片表面电势如山峦起伏，横向贯穿的管道中电势较低如山谷，而管道纵横交汇处三个深蓝色的坑，就是势能最低点，即为足以限制住生物粒子的势阱。从显微照相图（图3.D）中也可以看到，PMS微球被限制在设计好的陷阱中动弹不得。（说实话他不圈出来我肯定看不出那里停了个球）

图3. 多元复杂体系中单个生物粒子限制功能 A)微流控芯片示意图；B)微流控管道内电势分布；C)三维电势图；D)显微照相图

（2）在不需要标记物的情况下实现细胞选择性分析分类并分离出想要的细胞

同样图4.A所画的是这一装置的示意图，在分离分析细胞这一功能中，微流控管道的形状与之前有所不同，为三叉戟（嗯？）的形状，由于不同生物粒子在电场极化后带有不同的偶极矩，它们在电场中的行为也会不同，凭借这一特点，它们将在微流控管道的岔路口分道扬镳，实现分类分析的功能。将管道中电势分布画出来即如图4.B、4.C所示，在管道的偏左偏右有两条势能非常高的区域，横截面的电势分布即为图4.D，与图4.C相符。在荧光显微（图4.E左）和明场照相（图4.E右）中可以观察到，乳腺癌细胞和酵母细胞会流向带负电的区域，而PMS微球全部聚集在右边带正电的区域，分离效果比较好。

图4. 无标记物分类分离细胞功能A)微流控芯片示意图；B)微流控管道内电势分布计算图；C)电势分布局部放大；D)横截面电势分布图；E)显微照相图

（3）稀有细胞浓缩富集，也并不需要标记物

电极设计示意图如图5.A，在电极组成的十字路口，四周的电势是不同的，因此十字路口斜对角电势分布如图5.B所示，在唯一一块带正电的电极附近达到了最高值。因此可以确定，带负电的细胞只能富集在此处。源源不断的细胞流向此处，只能在这里停留，也就实现了浓缩，图5.C和5.D中就可以看到，乳腺癌细胞全部聚集在十字路口的这一头。如果我们改一改电极所带的电荷情况，比如说改成图5.E这样，富集区域就会跟着改变（图5.F&5.G）。

在图中橙色虚线为电极边缘，蓝色虚线为微流控管道边界。荧光叠加的细胞轨迹图中，红色为细胞，蓝色为大量细胞聚集区域。

图5. 稀有细胞浓缩富集 A)微流控芯片示意图；B)电势分布图；C)荧光显微照片观察到细胞富集；D)细胞轨迹叠加；E)改变电极带电情况；F)改变电场后富集区域改变；G)细胞轨迹叠加

（4）实时单细胞计数

这一功能的电极设计也非常巧妙，在微流控管道两侧，前后有两对矩形电极，而中间的电极是两块相对的三角形（图6.A），当单个细胞通过此处时，电场将发生变化，借此电信号即可实现细胞计数。如图6.B即为单个细胞通过三角形电极中间管道时的显微照片。此时这一平台的横截面电路可以等效简化为图6.C，灰色平台上红色的两侧电极形成了一个电容器，粉色的绝缘层也是电容，微流控芯片和液体带有电阻R，而实时通过的单个细胞电阻为△R，将电场线画出来就可以得到6.D图。实验中用到的电源为12V 900千赫兹的交流电，当单个细胞通过时，电极两侧电压，也就是电容器两端的电压有明显的降低，如图E所示，就是有6个PMS微球逐一通过的电势图，可以看到明显的6个峰。

图6. 实时单细胞计数 A)微流控芯片示意图；B)单个细胞通过电极显微照相图；C)等效电路图；D)单个细胞通过的电势计算图；E)6个PMS微球通过的实验测量电势图

这篇文章还完成了一些其他工作，例如确保生物芯片对细胞没有毒性，毕竟我们不希望一顿操作猛如虎，最后分析了一堆死细胞；调整液体在管道中的流速、电场的最适强度和频率等等。然而真正使这一工作称得上是芯片实验室（LOC）的，我觉得是，以上所有功能可以集成在同一片微流控芯片上（图7）。

图7. 全功能微流控纳米喷墨电子检测平台示意图

在不同区域可以实现上述各种功能，这样一来整个流程就是：加入一滴（微升到纳升级别）液体样本，经过（a）分选舱，不同细胞分开，我们不关心的部分就从（b）排出，而我们想要检测的细胞由于电势阱被限制在（c）处等待收割。如果稀有细胞量太少了，那就送到（d）富集一下，对于我们想计数的细胞，在通过（e）之前注射一些磷酸缓冲液（PBS）稀释一下，然后一个个计数。要是想分析多种细胞？送到下一个岔路口再来一次。

只用了你一滴血而已。

柔性PET电路甚至是开源设计的，研究人员和医生可以交流设计方案、免费下载可靠的电路图、花20分钟用喷墨打印机打印下来。在可能的应用场景中，医生从兜里掏出一把塑料纸，挑挑拣拣抽出一张PET电路板，再从另一个口袋里拿出灭菌封装好、随取随用的微流控芯片，撕开包装摆在电路板上。扎你中指取血是免不了的了，你还在那儿龇牙咧嘴疼呢，医生反手一个毛细管吸上100微升血样已经加到芯片上了。过不了多久，医生就能拿到足量的稀有细胞进行下一步检查。PDMS芯片随手就扔了，PET电路板继续揣兜里。

原文：Esfandyarpour, R., et al. (2017). "Multifunctional, inexpensive, and reusable nanoparticle-printed biochip for cell manipulation and diagnosis." Proc Natl Acad Sci U S A 114(8): E1306-E1315.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28167769/

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