用于微流控肺芯片应用的气液界面和优化的细胞培养基质

肺气液界面气体交换导论

肺是呼吸的主要器官，其功能是促进血液中的气体交换。空气沿着支气管树向下输送到肺泡囊，在那里气体与毛细血管腔通过空气-血液屏障进行交换(图1)。

支气管纤毛排列在呼吸道内，它们的跳动推动粘液和尘埃进入呼吸道。肺泡囊内衬有肺泡上皮细胞，这些细胞与下面的血管内皮细胞共用一层基底膜，形成一层薄薄的气液界面。对肺泡上皮细胞的压力增加了磷脂(肺表面活性物质)的产生，从而降低了肺泡壁的表面张力，从而改善了屏障功能。

肺器官芯片微流体：气液界面的模拟

下一代肺模型将半透膜结合到微流控三维芯片上器官技术中，目的是比传统的二维细胞培养更接近地模拟复杂的生理性肺微环境。由Huh等人设计的最先进的单芯片肺系统。在Wyss研究所，[1]包含两个腔室，模拟充满空气的肺泡囊和充满血液的毛细管腔，由代表空气-血液屏障的薄膜隔开(图2)。用柔性硅基有机聚合物聚二甲基硅氧烷(PDMS)模拟半透膜，在空气界面种植肺泡上皮细胞，在血浆界面种植血管内皮细胞。通过膜两侧的专用微流控通道通过真空引入循环应变，以模拟呼吸所面临的肺泡组织的生理压力，促进生理相互作用和功能的复制。具体地说，相邻细胞类型之间形成了连接，产生了肺表面活性物质，屏障孔隙度接近生理性。

图2：肺器官芯片微流控装置

模型气液界面的一个基本特征是它能够作为细胞培养的底物。这样的底物应该促进细胞附着、增殖、分化和相互作用，理想情况下，能够复制组织的关键功能特征，如气体渗透性、表面活性物质生产和纤毛跳动。在这篇综述中，我们简要概述了气液界面的重要特征，以及目前一些设计和修改它们的方法，以优化芯片上的肺模型。具体地说，我们着重于气液界面的物理、生化和机械性质的可调性。

图3：气-液界面设计和修改的物理、生化和机械考虑因素综述

方框1：PDMS。气-液界面通常用聚二甲基硅氧烷(PDMS)模拟。PDMS的优点是成本低、易于快速浇注、透气性好、光学透明度高、自发荧光低。它是柔韧的，相对柔软(弹性模数~1-3兆帕)。经等离子体氧化处理后，聚二甲基硅氧烷可与其他材料或自身结合。缺点包括缺乏细胞的生物和化学线索，以及高度疏水性。根据不同的应用，PDMS膜的渗透性、表面特性和柔软性可能会因调整而受益。

微流控装置中气液界面的物理设计考虑

膜的尺寸、形貌、孔隙率和溶胀等物理性质会影响细胞的行为(如黏附和迁移)，并影响屏障功能(如渗透性或渗漏)。集成对各种物理特性的更高控制将促进气液界面的微调和特定功能的优化。

孔隙结构
孔隙率决定了对气体和营养物质的渗透性，也调节了种植在膜两侧的细胞类型的迁移能力和相互作用。聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜是两种现成的选择，通常用于模拟气-液界面，并有多种孔径可供选择。多孔网络可通过颗粒浸出、气体发泡或冷冻干燥技术引入PDMS材料。或者，可以使用制造的模具和掩模(图4)以及使用各种光刻或蚀刻技术应用的图案来精确定制孔直径、厚度和孔与孔之间的距离。

图4.控制衬底孔隙率

拓扑
表面拓扑提供的物理(空间)线索调节细胞的附着、铺展和排列。值得注意的是，细胞的生理微环境很少是平坦光滑的表面。调节气液界面的拓扑结构可以更好地模拟组织的复杂纹理，如呼吸膜的大表面积和高曲率。材料表面可以是光滑的、纳米粗糙的，或者用一系列凹槽或定制设计图案化，通过光刻或蚀刻转移(图5)[4]。可调参数包括微槽的间距和高度、它们的相对方向(平行、半对齐或随机)以及边缘的角度(即矩形或圆形)。

图5.控制表面粗糙度和图案化

维度
天然细胞微环境的多层几何结构可以通过增加支架的维度来建模。具体地说，三维支架增强了细胞-细胞界面的形成和组织结构。模仿天然ECM支架的多孔纤维网络可以使用静电纺丝技术进行编织(图6)。纤维厚度、材料孔隙率和膨胀率可以通过调节流量来控制。另外，天然纹理的牺牲性铸造基板(例如，方糖)已被用于将复杂的三维建筑转移到PDMS。材料的膨胀或收缩程度可以通过选择所使用的聚合物和交联剂以及交联剂的密度来改变。

图6.不同流速下PDMS和弹性蛋白的电纺纤维基材

微流控装置气液界面的生化设计考虑
生物和化学刺激，如生长因子、药物、其他细胞和细胞黏附分子，长期以来一直被认为是细胞行为的重要调节因素(图7)。对气液界面进行修饰以加入蛋白质和其他生物活性化合物、调节底物的润湿性(疏水性)或加入官能团是改善在气液界面培养的细胞生长和功能的最常用方法之一。此外，基质的选择应确保降解不会导致细胞毒性副产物，也不会对基质孔隙率、拓扑结构或机械性能产生不利影响。

图7.细胞行为可能受到细胞或底物释放的生物分子或底物副产物的影响

表面疏水性
PDMS是一种疏水聚合物。疏水表面的一个缺点是许多小分子和荧光药物或染料非特异性地吸附。等离子体氧化处理使表面亲水，但效果只是暂时的(几个小时)。更持久地改善表面润湿性的方法包括涂覆多聚赖氨酸、非离子表面活性剂或吸附或固定配体、蛋白质或官能团。

基质蛋白
PDMS和其他合成聚合物基质的细胞生物相容性通常通过细胞外基质(ECM)蛋白的处理而增强，尤其是胶原和纤维连接蛋白[1]，它们促进和增强细胞的附着和增殖。溶液中的蛋白质可以通过涂层或微接触打印被吸附到PDMS的表面，或者使用一系列策略固定，例如用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)处理、交联剂(例如，戊二醛、基于聚乙二醇基的连接物)或等离子体活化。

官能团
可以引入广泛的官能团(例如甲基丙烯酸酯、磷酸盐、羧基、氨基、硫醇、丁基)，以帮助吸附和/或隔离生物分子，如糖蛋白和生长因子，以促进细胞生长[7]。官能团可以通过接枝或聚合的方法添加，包括表面等离子体活化和化学修饰。

微流控装置中气液界面的机械设计考虑
除了生化和物理信号外，越来越清楚的是，机械应力对细胞生长和组织功能同样重要(图8)。例如，基质硬度可以指导干细胞分化的谱系，基质应力松弛(一种粘弹性特性)调节细胞的扩散、增殖[10]和支架重构，呼吸过程中施加的机械应力影响纳米颗粒通过肺泡空气-血液屏障的摄取。与健康组织相比，肺气肿、纤维组织和癌症等疾病状态会改变基质硬度，影响疾病进展、重塑和修复过程中的细胞命运。微流控芯片肺培养提供了模拟生理流体切应力和呼吸动力的方法。因此，机械可调衬底有望增强这些模型的功能。

图8.基质硬度和粘弹性影响干细胞的命运

聚合物共混物
PDMS是由长的柔性单体链组成的，这些单体链以一定的间隔进行交联。一旦固化，这种柔性材料相对较软(弹性模数~1-3兆帕)，并表现出较低的粘弹性滞后(能量耗散)。改变基料与固化剂的比例(例如，5：1、10：1、20：1)会改变拉伸硬度，从而调节细胞生长。然而，使用非化学计量的碱基与连接物的比例可能会导致非交联型单体的缓慢释放，从而产生不良的效果。另一种方法是将不同的PDMS类型(例如，Sylgard 184和Sylgard 527)以最佳的碱基与连接物比例混合，从而产生超过三个数量级的刚性调制(弹性模数范围从5 kpa到1.7兆帕)。几种通常用作渗透膜的聚合物(如PC、PET和聚乳酸)由于其较高的(GPA)硬度而不太适合于包括机械刺激的应用。

ECM蛋白
纤维性细胞外基质蛋白主要对组织中的机械力做出反应，包括抗拉强度(胶原蛋白)和弹性拉伸和回弹(弹性蛋白)。不同的组织具有不同的结构蛋白组成，因此具有不同的机械性能，反映了它们的生理需求。将PDMS或其他合成聚合物与ECM蛋白质混合，为调节用作气-液界面的材料的机械性能提供了另一种策略。可以通过改变蛋白质组成、交联剂和交联剂密度来调整机械性能。