生物芯片的技术核心（上）

所有的生物芯片技术都包含四个基本要点：芯片的制作、杂交或反应、测定或扫描、数据处理。生物芯片的技术核心是芯片的制备及反应信号的检测。

1、芯片制备技术

目前制备芯片的方法基本上可分为两大类：一类是原位合成(in situ Synthesis)；一类是合成后交联(post-synthesis attachment)。原位合成是目前制造高密度寡核苷酸芯片最为成功的方法。在制备基因芯片时要考虑阵列的密度、再生性、操作的简便性、成本的高低等几方面的因素。

具体而言，比较典型的DNA芯片制备方法有4种：第一种方法是Affymetrix公司开发的光引导原位合成法，该方法是微加工技术中光刻工艺与光化学合成法相结合的产物。第二种方法是Incyte Pharmaceutical公司采用的化学喷射法，该方法是将合成好的核昔酸探针定点喷射到芯片上并加以固定化来制作DNA芯片。

第三种方法是斯坦福大学研制的接触式点涂法。在DNA芯片制备中通过高速精密机械手的精确移动让移液头与玻璃芯片接触，而将DNA探针涂敷在芯片上。第四种方法是通过使用4支分别装有A，T，G，C核昔的压电喷头在芯片上并行地合成出DNA探针。

光引导合成法与喷墨打印法、合成点样法相比，最大的优点是，它可以合成密度极高的阵列；但它的最大缺点是耗时、操作复杂，而且为保证在不同位点加上不同的单体，从而在不同的位点合成不同的探针，需要不断更换不同的蔽光膜，对一个含25个碱基的探针的微阵列，一般需更换100个蔽光膜，需一天多的时间才能完成。

合成点样法虽然芯片上探针的密度相对较低，每个样品都要预合成、纯化，在芯片制备前还需妥善保存合成的探针，但是它的最大优点是操作简便。目前很多公司采用这种方法来制备芯片。

2、样品制备技术

生物样品往往是各种组分的混合体，成分非常复杂，由于目前的检测体系还不能检测出未扩增的标记样品，所以待测样品DNA在杂交前一般都要进行聚合酶链反应(PCR)，在扩增的过程中，对靶DNA进行标记。

目前DNA样品的扩增一般是通过液相反应来完成，但由于低浓度核酸很难检测到，在溶液中通过PCR反应获得线性扩增也很困难；另外，不同靶DNA对引物的竞争，意味着某一序列的扩增优于其他序列。

为了解决上述问题，一些公司正在研究新的方法。如固相PCR系统，该系统是将2种引物排列在丙烯酰胺膜上，与DNA样品、PCR试剂混合，如样品含有靶序列，则开始扩增反应；通过这种固相PCR体系，可避免对引物的竞争，同时也降低了遗留污染。

不过也有不少人试图绕过样品扩增这一问题，如 Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法，引物特异性强，无交叉污染并且省去了液相处理的烦琐； Lynx Therapeutics 公司引入的大规模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ，可在一个样品中同时对数以万计的 DNA 片段进行克隆，且无需单独处理和分离每个克隆。

在芯片飞速发展的今天，样品制备已经成为芯片发展的瓶颈所在。对于较大规模制作芯片的用户，由于点样样品数目太多，即使采用高通量试剂盒还是不够方便。

世界上声誉卓著的核酸纯化供应商德国QIAGEN公司推出了全自动核酸和蛋白纯化工作站，该工作站有4个不同的自动纯化系统型号：BioRobot 8000，BioRobot 3000，BioRobot 9604，BioRobot 9600，加上QIAGEN优质的多种配套纯化试剂盒--从质粒、粘粒、RNA、血液基因组DNA、病毒DNA到蛋白，品种丰富，在欧美的生物医学市场上掀起了一场革命，各大分子生物学中心、芯片中心、医学中心争相抢购。

样品获得后要进行标记，目前样品的标记主要是荧光标记。荧光标记基本分为2种，一种是使用荧光标记的引物，一种是使用荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸。

目前常使用的荧光物质有：荧光素、罗丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根据扩增产物分离的方法不同，标记的方法也不同：进行单引物标记的，其扩增产物通常由聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；

对一个引物用生物素标记，另一个引物用荧光素标记的，一般用亲合素偶联的磁珠捕捉其扩增产物，通过变性处理使荧光标记的产物解链。

此外，也有用生物素残基标记引物，将生物素标记的扩增产物与芯片杂交，洗涤后加入亲合素连接的荧光物，通过生物素与亲合素的结合及靶序列与探针的结合产生荧光信号，然后利用荧光检测系统对荧光信号进行检测。

3、芯片点样技术

点样法是将预先通过液相化学大量合成好的探针、或PCR技术扩增cDNA或基因组DNA经纯化、定量分析后，通过由阵列复制器（arraying and replicating device，ARD）或阵列点样机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上（支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷），再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。

点样的方式分两种，其一为接触式点样，即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上；其二为非接触式点样，即喷点，它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2,500个探针；缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长；缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有1平方厘米400点。点样机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印头、一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。

现在已经有比较成型的点样装置出售，例如美国Biodot公司的“喷印”仪，以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”仪。这些自动化仪器依据所配备的“打印”或“喷印”针将生物大分子从多孔板吸出直接“打印”或“喷印”于芯片片基上。“打印”时针头与芯片片基表面发生接触而“喷印”时针头与片基表面保持一定的距离。所以，“打印”仪适宜制作较高密度的微阵列（例如2500点/cm2），“喷印”法由于“喷印”的斑点较大，所以只能形成较低密度的探针阵列，通常400点/cm2。点样法制作芯片的工艺比较简单便于掌握、分析设备易于获取，适宜用户按照自己的需要灵活机动地设计微点阵，用于科研和实践工作。目前，除了在生物芯片研制方面享有盛誉的Affymetrix公司等个别公司使用原位合成技术制造芯片外，大多中小型公司普遍采用点样技术制作生物芯片。

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