循环肿瘤细胞的检测方法（一）

 近年来随着现代医学研究技术的进步和CTC临床应用价值凸显，许多研究机构和研发团队都在推出不同的CTC检测技术。由于血液中CTC的含量极低，目前主流的检测方法是先捕获（富集）后检测，少量方法是不捕获（富集）直接检测。CTC检测技术包括CTC的富集（分离）和CTC的分析鉴定（识别）。本篇文章将介绍CTC的富集和分析方法，尤其重点介绍CTC的富集方法。

 一CTC富集方法的分类和原理

人体循环系统中CTC的含量极低，肿瘤转移患者每毫升全血中仅有1～10个CTC，因此要实现CTC的检测对其进行分选富集是一个关键的步骤。CTC分选富集效果的优劣将会直接影响其后续的检测效果，因此高纯度、高灵敏性（不丢失CTC）、快速、高细胞活性的CTC分选富集是CTC临床应用的重点和难点。

CTC的富集方法可以分为生物化学特性富集法（亲和性富集法）和物理特性富集法。亲和性富集法主要是根据通过细胞表面特异性表达的蛋白质生物标志物分离靶细胞，包括正向捕获CTC的阳性富集法和负向去除白细胞的阴性富集法。物理特性富集法主要是根据CTC的大小、密度、力学和介电性能等物理特性将CTC筛选出来。

1.1 亲和性富集法

亲和性富集法根据结合的靶细胞是CTC还是白细胞，可分为阳性富集法和阴性富集法。阳性富集法主要利用特异性抗体与肿瘤细胞表面抗原进行特异性结合来富集CTC。CTC分为上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮间质细胞混合表型，因此用于CTC阳性富集的特异性抗体分为识别上皮标志物、识别间质标志物和识别上皮间质标志物三种。其中，上皮标志物在正常上皮细胞和上皮肿瘤（即癌）上表达，但在间质白细胞上不存在，因此经常用于区分癌细胞和正常血细胞。上皮细胞粘附分子（EpCMA）是最常用于上皮表型CTC阳性富集的细胞表面标志物。此外，由于细胞骨架蛋白对于上皮细胞具有特异性，细胞角蛋白家族成员（即CK8，CK18和CK19）已经成为检测具有上皮表型癌症患者CTC的“金标准”标记物。阴性富集法也称白细胞去除法，通常用识别CD45或CD14的特异性抗体与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞。

除了特异性抗体，亲和性结富集法的某些技术采用与CTC或白细胞表面抗原特异性结合的多肽或适配体（aptamer，一种单链DNA或RNA分子，与目的蛋白有很高的亲和力和特异性）替代抗体来实现阳性或阴性富集。

生化特性富集法

1.1.1 免疫磁珠技术

亲和性富集法目前基于免疫磁珠技术和微流控芯片技术对CTC进行富集。免疫磁珠技术是根据免疫亲和的原理，将免疫磁珠与捕获抗体或特异性多肽（可与血液中的CTC或白细胞表面抗原相结合）相连接，随后通过磁场即可将磁珠捕获与未捕获的细胞分离。

基于免疫磁珠技术的亲和性富集法的原理

1.1.2 微流控芯片技术

微流控（microfluidics）是一种精确控制和操控微尺度流体，以在微纳米尺度空间中对流体进行操控为主要特征的科学技术。微流控芯片是微流控技术实现的主要平台和技术装置，因其样品量小、流速可控及构件透明性等特点，已被广泛应用于CTC的分选富集中。微流体芯片技术基于亲和性富集法分离CTC时，芯片内部的微通道或微结构上修饰能够与CTC或白细胞表面抗原结合的特异性抗体或适配体，当血液流经芯片时，特异性抗体或适配体可与目的细胞表面抗原结合，随后将CTC或白细胞粘附在芯片上，实现CTC的阳性捕获或阴性富集。

基于微流体芯片技术的亲和性富集法的原理

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