浓度梯度微流控芯片平台的构建及其应用于抗白念珠菌药物快速筛选研究结果

1 染料定性表征浓度梯度

随着荧光素钠与苋菜红流速比的增加, 荧光素钠成分在通道中所占比例逐渐增加。当流速比 < 1时, 苋菜红在4个通道中含量较高(图 2A~D); 当流速比 > 1时, 荧光素钠在4个通道中含量较高, 不利于拉开浓度差异, 形成浓度梯度(图 2I~L、M~P); 当两水相流速比为1时(即流速均为100 μL·h-1), 芯片可以生成较好的浓度梯度, 接近于线性浓度梯度(图 2E~H)。同时, 结果可以看出当流速差异较大时, 两水相分界清晰, 流体在流动过程中不能充分扩散(图 2I~L、M~P)。所以选择两水相流速均为100 μL·h-1作为后续药物筛选实验时的水相流速。

2 HPLC定量表征浓度梯度

氟康唑在1~100 μg·mL-1内线性良好, 回归方程为f = 1 769.3×C - 1 507.3 (r = 0.999 7)。空白溶液与100 μg·mL-1氟康唑溶液流速比1:2、1:1、2:1, 分别收集4个通道样本进行检测, 结果见表 1。当流速为1:2和2:1时, 溶液流速差异大, 高流速溶液流经同样距离所需时长越短, 横向扩散距离也较短, 分支中溶液混合情况差, 难以形成线性浓度梯度。当空白溶液与工作溶液流速比为1:1时, 各分支溶液能够较充分混匀从而能够获得更加接近线性的浓度梯度, 与荧光素钠对芯片浓度梯度定性结果一致。

3 浓度梯度微流控芯片的系统考察

为了生成大小均匀、形状稳定的液滴, 考察了芯片上的水油两相流速, 见图 3。结果表明, 水相流速100 μL·h-1、油相流速200 μL·h-1时, 液滴大小均一, 形态良好, 液滴直径约为47 μm, 体积约54 pL, 生成速度约为每秒2.6×104个。收集的液滴涂布于载玻片上观察, 液滴形态比较稳定, 尺寸均一, 放置3天, 液滴仍能保持形态完好, 稳定性高, 完全满足实验要求。

4 液滴包裹白念珠菌考察

白念珠菌菌液与空白培养基作为两水相包裹形成液滴后, 涂片于载玻片, 显微镜下拍照观察。对液滴直径进行测量和标记, 结果发现液滴直径基本为46.64 μm, 尺寸大小基本保持一致, 液滴均一性良好。白念珠菌经活死染料标记, 可以清晰地观察到大多数液滴为空液滴, 而包裹了白念珠菌的液滴基本为单包裹。由于白念珠菌浓度为0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1, 菌液浓度相对较低, 分散到每个液滴内的白念珠菌基本为1个或没有, 因此液滴绝大多数为单包裹(图 4)。在单细胞包裹液滴中, 当药物抑制或者杀灭真菌细胞时, 无荧光亮液滴, 显示与空液滴一样的背景色。当药物浓度低于MIC时, 真菌细胞有生长活性, 指示剂转化产生荧光亮液滴, 而空液滴保持不变。由此可以判断药物的MIC。因此, 通道内白念珠菌的浓度梯度分布不影响后续的药物筛选实验。

5 基于浓度梯度微流控芯片的抗真菌药物快速筛选研究

分别测试高低浓度的两性霉素B的抗白念珠菌作用, 高浓度组水相分别为含16.0 μg·mL-1两性霉素B的药物溶液和含终浓度为0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1白念珠菌的溶液, 低浓度组两性霉素B浓度为4.0 μg·mL-1, 其余组成相同。16.0 μg·mL-1两性霉素B浓度梯度微流控芯片抗真菌活性实验结果见图 5。空白对照组中液滴只包裹了药物溶液(无菌), 可见液滴颜色均匀一致为背景的红色, 液滴无荧光(图 5A); 生长对照组(无药), 荧光亮液滴较多(图 5D), 图 5B~C中液滴无荧光, 表明白念珠菌的活力被两性霉素B抑制, 无法有效转化荧光指示剂产生荧光。

4.0 μg·mL-1两性霉素B液滴实验结果见图 6, A~D分别为通道1、通道2、通道3、通道4出口处收集液滴孵育2 h后的结果。根据氟康唑浓度梯度定量表征结果推算, 图 6A~D中两性霉素B分别为4.0、1.6、0.5和0 μg·mL-1。A为空白对照组, 无荧光亮液滴; D为正常生长对照组, 产生大量亮液滴。图 6B中所示为药物溶液与菌溶液混合后的液滴作用情况, 液滴中无明显荧光信号产生, 表明该浓度条件两性霉素B可以有效抑制白念珠菌生长, 两性霉素B浓度约为1.6 μg·mL-1; 图 6C中可以看到液滴存在明显的明暗区别, 表明液滴内包裹的白念珠菌未能被有效抑制, 而两性霉素B浓度约为0.50 μg·mL-1, 因此可以得出两性霉素B的MIC值在0.50~1.60 μg·mL-1内, 与CLSI所建议的两性霉素B对白念珠菌的MIC≤1 μg·mL-1相一致。结果表明本研究建立的浓度梯度微流控芯片平台可以用于快速测定抗真菌候选化合物的MIC, 通过一次实验获得化合物的MIC范围(表 2)。

氟康唑、卡泊芬净、特比萘芬等药物结果与96孔板法一致。图 7显示了16 μg·mL-1特比萘芬抗白念珠菌药物筛选实验结果。其中, 7B~D中均有荧光亮液滴, 说明两种浓度的特比萘芬均不能有效抑制该批次白念珠菌的活性, 该批次白念珠菌对特比萘芬产生了耐药的现象。有文献报道, 在临床获得的白念珠菌样品中, 对特比萘芬的耐药比例达94.93%, 而伊曲康唑和咪康唑的耐药率则只有15.21%和5.99%。本研究所建立的抗白念珠菌药物筛选的方法也可以应用于临床耐药菌株的药物筛选研究。

讨论

在微流控芯片上生成浓度梯度具有自动化、微型化、高通量的优点, 因此被广泛应用于药物筛选、细胞生物学等研究领域。本研究采用液滴微流控技术结合浓度梯度生成的芯片包裹白念珠菌进行抗真菌药物活性快速高效测试。通过荧光示踪剂荧光素钠和苋菜红色素考察芯片上两水相流速比对浓度梯度形成结果的影响, 并对芯片浓度梯度进行了定性表征, 结合HPLC对通道内氟康唑浓度的定量从而对芯片浓度梯度进一步进行定量表征。浓度梯度定性与定量结果一致表明, 当两水相流速比为1 : 1时, 流速为100 μL·h-1时, 芯片内浓度梯度分布更加均匀, 浓度梯度分布接近线性, 适用于后续药物筛选实验。通过活死染色考察芯片上浓度梯度生成器对白念珠菌在通道中分布及液滴内包裹白念珠菌情况的影响, 结果发现液滴内白念珠菌基本为单包裹, 药物作用对象保持一致。

采用本实验室设计制作的浓度梯度液滴微流控芯片, 测试了8种临床常用药物的抗白念珠菌作用效果。通过对两性霉素B、氟康唑及特比奈芬等药物的作用效果考察发现, 芯片结果与孔板法一致, 并与M27-A3标准所认定的MIC值相符, 表明本研究建立的多浓度梯度液滴生成芯片平台可以用于抗真菌活性化合物的快速筛选及临床耐药菌株的筛选研究。传统孔板法药敏实验需要耗费大量人力物力, 难以实现高通量分析。

近年来, 浓度梯度微流控芯片技术逐渐兴起, 出现大量能够产生线性和非线性浓度梯度的微流控芯片, 但其结构网络较为复杂、制作要求较高, 芯片稳定性和重现性易受影响。本文建立的浓度梯度液滴微流控芯片平台将浓度梯度生成器和液滴生成结构组合在一起, 浓度梯度生成器采用经典的“圣诞树”结构, 可通过简单地增加分支数目而获得更多的浓度梯度分布, 结构简单易于制作, 并且芯片稳定性高, 易于操作, 能够快速生成较为精确、稳定的浓度梯度。将该平台应用于抗真菌药物筛选, 可以省去配制多种不同药物浓度溶液的繁冗过程, 同时简化了细胞铺板、给药、标记等过程。在短时间内可以生成大量液滴, 每个液滴作为独立微反应器, 作用结果互不干扰, 增加了实验结果的可靠性与准确性。后期通过改进芯片“圣诞树”结构浓度梯度分支数目, 增加芯片的浓度梯度生成数量, 可以将一次实验所获得的浓度梯度间隔划分的更小, 有望通过一次实验获得精确的MIC值; 通过改变浓度梯度生成器结构, 可以产生正交浓度梯度用于联合用药的研究。

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