高通量自动化微生物微液滴进化培养

微生物培养是微生物科学研究和工业应用领域的重要基础，广泛应用于微生物的分离、鉴定、分析、筛选、驯化、适应性进化、菌株改造等方面。然而，传统微生物培养方法主要以试管、摇瓶、固体平板为培养容器，辅以摇床、分光光度计、酶标仪等设备进行微生物的培养、检测和筛选，存在操作繁琐、效率低、耗时、耗力、耗物等问题。近年发展起来的高通量培养手段主要是以微孔板为容器建立起来的培养筛选体系，但微孔板一方面溶氧水平低，混合效果差、蒸发效应和热效应比较严重，常常导致菌种生长状况差，且差异性大；另一方面需要配套昂贵的设备，如移液工作站、酶标仪等，才能实现自动化培养和过程检测。

液滴微流控作为微流控技术的重要分支，是近年来在传统连续流微流控系统基础上发展起来的，利用互不相溶的两液相产生分散的微液滴并对微液滴进行操作的非连续流微流控技术[7]。微液滴具有体积小、比表面积大，独立无交叉污染等特点，再结合液滴可控性强、通量高等优势，已经有研究将其用于微生物的高通量培养、驯化、筛选等方面，展现出重要的应用潜力。然而，液滴微流控从实验室技术走向应用推广仍然存在一系列关键问题。首先，液滴微流控操作繁琐精细，技术要求和门槛高；其次，液滴微流控技术涉及光、机、电的元部件联合使用，且需要和生物技术应用场景结合，如果没有多学科交叉协作，一般单个实验室或团队难以搭建高效的液滴微流控系统，从而无法开展液滴在微生物技术中的广泛应用研究；再次，由于液滴体积极小(皮升–微升)，面向微生物传代、进化和分选的等基本操作的自动化液滴精确操控与实时在线检测实现难度大，难以形成一体化装备系统。

液滴发生

基于微流控芯片的液滴发生技术常见的有3种，分别为流动聚焦法、十字通道法、T形通道法，并且常常通过调节油相和水相的进样流速来控制生成液滴的大小。但由于芯片加工通常存在批次间误差以及水相粘度差异等问题，不同芯片往往需要调整油相和水相的流速参数，才能形成稳定的微液滴，这些问题一直是微流控芯片应用于微生物培养的关键技术挑战。如何低成本地设计能够兼容芯片批次间误差和样品粘度差异等实际情况，且可以高精度地对液滴进行操作的芯片系统成为关键。考虑到T形通道结构简单易加工、成本较低，本研究将该结构引入芯片设计中。为了克服芯片批次误差和样品粘度差异等问题，采用独特的油相和水相间歇顺次驱动进样方法，进而在芯片中生成体积大小精确可控的微液滴(图 4A)，并通过巧妙串联使用T形结构通道，可以生成浓度梯度不同且精确可控的微液滴(图 4B)。

图 4 液滴操作系统：(A：液滴发生；B：多浓度梯度液滴发生；C：液滴分割融合；D：液滴分选)

液滴培养

微生物培养过程通常需要提供合适的温度、氧气等条件。基于微流控的好氧微生物培养，常常用透气性良好的PDMS作为芯片材质，辅以环境温度控制，来满足微生物的生长需求。但是PDMS具有柔性较大、易形变等特点，给液滴的精确稳定操作带来了极大的负面影响，所以不适合用于本研究。因此，如何既能够实现液滴培养的气体交换，又具备良好刚性和光学性能的芯片系统成为微生物微液滴培养的关键。而从目前已开发的芯片材质分析，透气性和刚性往往不可兼得。为此，本研究提出了将液滴操作和液滴培养两个过程分离的思路，即利用刚性强、光学性能优的材料加工微流控芯片，利用透气性强、变形性小的微管路作为液滴培养的容器，实现硬质芯片与透气培养管路的有机结合，成功解决了微生物微液滴培养的难题。液滴在系统运行过程中，不断往复于培养管路之中，进而充分满足培养过程中气体交换的需求。

 液滴分割融合

微生物的传代培养操作中，需要将培养到一定阶段的菌悬液取出一部分，接种到新培养基中，继续进行传代培养。在本研究需要实现将已培养的微生物微液滴向新培养基液滴中接种菌液，实现基于微液滴的微生物传代培养操作。传统的液滴分割融合方式常常利用芯片结构对已培养的所有母液滴进行分割，生成两个子液滴，其中一个子液滴则直接从废液口排出，待所有液滴完成分割后，再将所有待利用的子液滴与新培养基液滴进行融合，从而完成液滴的微生物传代。但在对已培养的母液滴进行分割处理中，往往存在液滴的识别和驱动过程误差，造成液滴切割融合的精确性下降，而长期多次操作会进一步导致单次操作误差的累积，造成最终的液滴体积差异过大，稳定性差等问题。另外，如果分割后的子液滴体积较小，则其在往复运动过程中容易发生相互融合，影响系统稳定性。如何能够精确实现液滴分割融合操作、避免误差累积、降低液滴之间融合风险、提高系统运行稳定性成为液滴传代操作的关键。为解决液滴分割融合误差的问题，本研究创造性地提出“掐头去尾”式的液滴分割融合新方法(图 4C)，即液滴经过识别点时，液滴体积的大部分停留在注入通道中，通过推动主通道中油相流动，对驻留液滴暴露在主通道中的小部分头部体积部分进行切割，将液滴分割成两部分，头部液滴部分被推入废液通道，另一部分则停留在驻留通道中；此时，将新培养基液滴推动至液滴注入通道口处，然后将被切割液滴定量进入新液滴，再次推动融合后的液滴离开注入通道口，而残余的液滴尾部则也被推入至废液中。同时，这种巧妙的液滴操作方式，使得液滴的分割和融合过程紧密相连，避免了小体积液滴长时间运行而可能造成的相互融合，极大提高了微液滴系统运行的稳定性。

液滴分选

液滴从生成开始，通过液滴识别系统对每个液滴进行编号，每个液滴的所有检测数据都会与对应编号的液滴进行匹配，因此在分选操作实施前，液滴经过识别点进行编号识别，根据培养过程微液滴OD检测数据，如果是所需液滴，就会通过阀口，收集至收集管中，如果是废弃液滴则被推入下游管路，继续下一个液滴的分选处理(图 4D)，进而实现目标微生物微液滴的分选。

芯片集成化设计

在实现微液滴发生、培养、分割融合、监测、分选的基础之上，本研究对这些功能结构进行了系统集成，形成了功能完备的集成化微流控芯片系统(图 5)。其中2号、4号、6号与进样瓶相连，分别用以盛放种子液、新鲜培养基、化学因子母液。1号、3号、5号均是油相通道，直接与注射泵相连。1号、3号管路为长度为2 m的透气性良好的AF-2400材质管路(内径=1 mm，外径=1.6 mm)，液滴在两者之间进行往复运动。废液管与阀相连，用以排出废液。芯片中的液滴识别点、光谱检测点则分别作为液滴识别窗口和光谱检测窗口。芯片系统整体置于恒温控制仓中，保证微生物培养提供所需的最适温度。

集成化微流控芯片系统结构示意图

液滴微流控技术因生成的液滴体积小、通量高、质能交换快、可独立操作等特性为微生物研究提供了新方法，但其操作要求高、影响因素多、缺乏自动化集成等问题限制了该技术的应用推广。本研究针对上述关键难题，通过设计开发液滴识别功能模块、液滴检测模块、进样模块以及芯片模块等，将液滴的发生、培养、检测、分割、融合、分选等多种复杂操作进行有机集成，成功研制出了一款全自动高通量微生物微液滴培养系统(MMC)，形成了小型化、自动化、高通量的微生物培养系统，并且操作简单，运行稳定。相比于传统的微生物高通量培养装备，MMC具有物料消耗少、操作简单、在线检测(OD和荧光)、数据采集密度大、普适性强等多种优势。

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