利用微流控芯片制备海藻酸钠微球

1、什么是海藻酸钠微球

海藻酸盐(海藻酸钠)又称褐藻酸钠，是一类从褐藻、海带、马尾藻、巨藻等可食用的海洋藻类植物的细胞壁中提取出的天然线性多糖，由1-4糖苷键键合的β-D-甘露糖醛酸(M单元)和α-L-古洛糖醛酸(G单元)残基组成。海藻酸钠作为微球载体材料已经多有报道，如刘善奎等利用乳化-交联法制备的DNA疫苗海藻酸钠微球，其粒径在12.03±6.9μm，载药量为5%，包封率为56%，药物释放维持10天。以下图1是海藻酸钠结构式。

图1 海藻酸钠的结构式

海藻酸钠微球的研究意义：在药剂学中，微球(microspheres)是指药物被溶解、分散或被吸附在药物载体材料如高分子聚合物中而形成的骨架型(matrixtype)球形微粒。微球的主要作用包括：靶向性作用、缓释与控释作用、栓塞作用、降低药物刺激性和提高药物稳定性作用。微球栓塞剂的性能也随着介入治疗在临床治疗中地位的提升而逐渐引起科研人员的重视。介入栓塞术是借助于导管将栓塞剂选择性地导入到癌症组织动脉血管和微血管，以达到阻断肿瘤组织营养供给，抑制其生长的目的。另外，对于无法手术治疗的肝癌患者，介入栓塞术可控制病变部位恶化，减少患者疼痛，起到提高生存质量的作用。栓塞剂对栓塞术的成功起着至关重要的作用。综合来说，一种理想的栓塞材料应该具备无毒、无抗原性、生物组织相容性好、可根据病灶要求控制栓塞时间等特点，而且制剂易制备，易导入，易灭菌，粒径的均一性可控性，成本低廉也是选择栓塞材料必需考虑的重要因素。天然多糖高分子微球由于具有良好的生物相容性和生物可降解性而备受介入治疗领域的关注，在临床应用方面具有良好的前景。海藻酸钠是一种常用的天然多糖高分子材料，由L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸两种糖单元构成。海藻酸钠主要由海藻类植物提取而来，具有易得、易改性、生物相容性良好等优点。海藻酸钠可与Ca2+，Zn2+等离子交联反应形成“蛋盒”结构，产生大分子链间交联固化，可根据临床需要加工制备成各种粒径大小的固态微球。海藻酸盐微球具有良好的力学稳定性和生物相容性，栓塞血管后无免疫反应，且其可降解性使得一段时间后以分子链脱解的形式降解，终产物为能为人体代谢的多糖。目前国内已有海藻酸钠微球血管栓塞剂上市，但产品存在粒径分布范围广、尺寸不可控、只能通过粒径控制降解周期等问题，粒径不均一、不可控的微球在临床使用过程中容易造成除靶血管外的其他组织或器官栓塞，尤其是粒径微小(20μm以下)的微球容易通过血液流向肺部，造成危及生命的肺部栓塞;只通过粒径控制降解周期的微球，不能很好地满足病灶点的栓塞要求，容易出现粒径合适但是栓塞时间不充分的情况，不仅影响治疗效果，而且需多次栓塞给病患增加麻烦。目前研究中制备载药海藻酸钠微球的方法，大多采用静电生成法、相分离法、复相乳液法或搅拌乳化法形成液滴，然后与钙离子交联形成微球。以上方法制备的微球粒径分布较广，不易控制，且不易实现规模化生产。目前有望解决上述问题的是利用微流控芯片技术制备海藻酸钠微球，该方法制备的海藻酸钠微球粒径均一、尺寸可控，在同一粒径范围内可控制其降解速度。

2、利用微流控芯片技术制备海藻酸钠微球的原理及方法

使用微流控芯片技术制备海藻酸钠微球，常采用流道聚焦法来生成油包水的微液滴。如下图所示，在流动聚焦法中，三条流路聚焦一个管道中，分散相和流动相汇合于十字交叉管处，上下对称的流动相同时挤压分散相使其断裂，从而形成液滴。通常分散相为海藻酸钠水溶液，流动相为油相，两相流经聚焦型结构的十字处，挤压形成海藻酸钠液滴。

图2 流道聚焦法制备海藻酸钠微球

3、制备海藻酸钠微球所需的试剂

(1) 微滴生成油 (含2% 表面活性剂的HFE-7500 (wt%))

(2) EDTA (0.5 M, pH 7.4 Macklin, E885215-1L)

(3) NaOH (Macklin, S817971-500 G)

(4) CaCl2 (无水, 99.99%, Macklin, C805228-100 G)

(5) 海藻酸钠 (黏度 200 mpa.s)

(6) 乙酸 (99.8%, Macklin, A801296-500 ML)

(7) 1H,1H,2H,2H-全氟己-1-醇 (PFO, 98%, Macklin, H817022-25 G)

(8) HFE-7500 (3M NovecTM)

(9) n-Hexane (正己烷, HPLC, H810749-1L)

(10) SpanTM 80 (Aladdin, S110839-250 ML)

(11) 去离子水

4、制备海藻酸钠微球所需的实验仪器

(1) 两通道微流控芯片进样用恒压泵也称压力控制器

(2) 100 μm剪切口疏水的微流控玻璃芯片(液滴)

(3) 配套微流控玻璃芯片夹具

(4) PTFE 管(0.6/1.6 mm)若干

(5) 配有高速相机的普通光学显微镜及配套软件

(6) 两个流量传感器 (规格: 80 μL/min)

(7) 两个储液池 (规格: 15 mL和50 mL)

(8) 水平旋转仪

(9) 万分位电子分析天平

(10) 梅特勒pH计

(11) 高速离心机

(12) 100 μm细胞滤网

(13) 20 mL透明玻璃瓶

(14) 玻璃培养皿 (直径100 mm)

图3 采用微流控液滴芯片制备的海藻酸钠微球粒径分布

5、制备海藻酸钠微球的溶液配制方法

（1）4 M NaOH

取8.0 g NaOH置于50 mL Falcon离心管中，用去离子水溶解并定容至50 mL。

（2）5 M CaCl2

取11.1 g CaCl2置于50 mL Falcon离心管中，用去离子水溶解并定容至20 mL。

（3）2 %海藻酸钠水溶液 (wt%)

取0.2 g 海藻酸钠置于15 mL Falcon离心管中，加入去离子水至10 g。

注意：溶解海藻酸钠时用时较久，要不断的超声并涡旋振荡，最后静置将个别碎沫慢慢溶解 (以上仅为个人建议，不同厂家溶解效果也不一样，能否做出也未可知)。

（4）400 mM Ca-EDTA

取400 μL 的5 M CaCl2 ，4 mL EDTA (0.5M, pH7.4)加入20 mL 透明玻璃瓶中并振荡均匀，然后用 4 M NaOH调整pH至7.2，最后加入去离子纯净水定容至5 mL。

注意: 调pH加NaOH溶液时，需少量多次。初始pH为3.65左右，待加至pH为5.6以上时需尽可能减少NaOH溶液加入的量，适当可用移液枪取1 μL 或更少的量加入。

（5）1% 海藻酸钠 (wt%)- 200 mM Ca-EDTA

将2 % 海藻酸钠水溶液和400 mM Ca-EDTA等体积混合，使用0.22 μm PTFE微孔膜过滤。

（6）20% PFO/HFE-7500 (v/v)

取5 mL PFO 置于50 mL Falcon离心管中，用HFE-7500定容至25 mL，振荡均匀。

（7）1% Span 80 in Hexane (v/v)

取0.3 mL Span 80加入Hexane定容至30 mL，振荡均匀.

（8）2 % 乙酸/微滴生成油 (v/v)

取200 μL 的乙酸加入 15 mL Falcon离心管中，用微滴生成油定容至10 mL，振荡均匀。

6、利用微流控芯片技术制备海藻酸钠微球的实验操作

(1) 连接设备、储液池和两路流量传感器；

(2) 将微滴生成油和1% 海藻酸钠-200 mM Ca-EDTA水相分别加入至50和15 mL的储液池中;

(3) 用软件控制分别给两个通道一定的压力以排出管路中的空气，待有液体流出时再分别关掉压力;

(4) 分别将油相和水相管插入经疏水处理的玻璃芯片对应的油相和水相入口（玻璃芯片安装在夹具上，直接将导管插入夹具即可），然后取一段30 cm PTFE管插入玻璃芯片出口；

(5) 用软件控制并设置流速，比如油相流速为70 μL /min，水相流速为7 μL /min;

(6) 待微球稳定生成后，将装有10 mL 2%乙酸微的滴生成油的玻璃培养皿放置于管路出口开始收集，且收集过程中需要用水平旋转仪振荡;

(7) 注意：水平旋转仪振荡速度50 rpm/min以下，且保证收集的微球一直能滴入培养皿中；收集时可以用保鲜膜盖在收集管上尽量减少乙酸的挥发

(8) 收集完毕后可以适当补充乙酸以保证其浓度基本维持不变，然后振荡固化12 h；

(9) 待固化完全后，5000 rpm, 3min离心处理；

(10) 用移液枪取出底部油相，然后按2:1 (vPFO:v微球)加入20% PFO的HFE-7500，5000 rpm, 3min离心处理至少两次;

(11) 用移液枪取出底部溶液，然后按2:1 (vn-Hexane:v微球)加入1% Span 80的n-Hexane，5000 rpm, 3min离心处理至少两次；

(12) 用移液枪取出上部溶液，加入一定体积PBS 5000 rpm, 5min离心处理，最终分散于PBS中;

(13) 固化后的微球可以用100 μm细胞过滤器过滤。

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