基于微流控双水相液滴流酶促反应的尿素检测

在工农医等行业，如水质、土壤、食品和药品中，检测尿素的含量有着重要的意义。实验室常规尿素检测方法如凯氏定氮仪法和市售的尿素测定仪均有着耗时长、仪器昂贵和化学试剂用量大等缺点，还伴随着不可避免的环境污染。另一类常见的检测方法如拉曼光谱和电化学法，操作复杂且成本较高。还有一些科研工作者提出用显色法或显色试纸的方法来检测尿素含量。1986年，高世忠等[7]提出了二乙酰一肟与尿素反应生成有色复合物的方法，通过是否显色来判断有无尿素，但二乙酰一肟并非只与尿素反应显色，与其代谢产物瓜氨酸反应也有显色，此种测量方法并不能排除瓜氨酸对尿素浓度的影响。2009年，杨水云等发明了一种检测尿素含量的试纸，制备试纸的过程较为复杂且不易保存，保存和现场测试过程中较易受环境因素如pH值、湿度等的影响。2012年，喻东威等提出了一种定性检测尿素的方法，用溴百里香酚蓝乙醇溶液对尿素的酶溶液进行显色反应。该方法只能通过阳性对照组来比较，且操作过程复杂，试剂用量大，易对环境造成污染。

微流控技术由于消耗样品和试剂量少、分析速度快、便携以及高自动化水平等优点引起了生物化学分析领域的诸多关注。由于酶的高选择性、灵敏度和快速性，通过微流控酶促反应进行分析检测已有诸多报道。Schekman等通过微流控油水液滴可实现超高通量定向进化分选，但需要复杂昂贵的设备如电场、激发光源等。并且，引入环境不友好的油相可能会影响酶的3D结构。因此，实现一种简单、快速、可视化、生物相容的分析检测方法仍是一个持续的挑战。双水相生物相容性好，具有选择分配性。通过双水相产生稳定均一的液滴流的方法已日趋成熟，在功能材料的制备、生物活性物质的包封和培养等领域均有报道。双水相的上述特点对于有生物活性物质参与的分析检测有巨大的潜力。基于此，我们构建了一个基于酶促反应的微流控双水相液滴流平台用于尿素检测。如图 1所示，在同轴环管型毛细管微装置中，利用两相流体的剪切作用在锥口处产生聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)液滴(图 1A)，液滴内含有尿素和中性红指示剂，外相含有脲酶；尿素与脲酶在双水相液滴界面发生酶促反应(图 1B)，产物大部分富集于PEG相(图 1C)，根据检测处的颜色强度判断样品中是否含有尿素以及分析含量的高低。 

图 1.  微流控双水相液滴尿素检测机理图

 实验部分

1   试剂和仪器

Dex(5.0×105), 脲酶(20 KU), PEG(Mw=8000), Sigma-Aldrich中国；中性红，尿素，无水乙醇，丙酮，氯化钾，以上试剂均为分析纯，购自成都科龙化工试剂厂；环氧树脂AB胶；去离子水。

生物显微镜；DDS-12DW型电导率仪；微通道注射泵；IXUS 60型数码照相机；ST-1/NS型尿素测定仪；TGL-16型高速冷冻离心机；Color squid型磁力搅拌器；FA2204N型电子天平；OB-128型旋转搅拌器；水浴恒温振荡器；硼硅玻璃毛细管；一次性注射器；P-97型拉针仪；ZYCGF-Ⅱ-10/20T型超纯水机。

2   双水相液滴流产生方法

1   微装置的设计与制作

基于酶促反应的微流控双水相液滴流是通过微流控装置产生的，该装置由玻璃毛细管和连接针头制成。采用不锈钢钻头对连接针口底部进行打孔，外管内径为1 mm，外径为1.2 mm。内管内径为0.55 mm，外径为1.0 mm。用拉针仪使内管一端口径变小，能够在微流控装置中产生微小液滴，利用砂纸将圆形毛细管针头打磨平整。利用载玻片作为装置基底，将玻璃毛细管和针头按图 1组装好，用全透明环氧树脂AB胶固定密封。

2   双水相的制备

双水相是由质量分数为8%的Dex和8%的PEG分别溶于去离子水混合而成，磁力搅拌3 h充分混合后静置12 h使其相分离。上层为PEG相，下层为Dex相。

3   双水相液滴流的产生

液体通过聚乙烯管连接到由注射泵控制的注射器。PEG相和Dex相分别作为内、外相泵入微流控装置中，在通道内形成PEG/Dex液滴流。

4   酶促反应平台性能测定

4.1   双水相液滴流中的酶促反应显色实验

包含脲酶的Dex溶液从外相入口进入，包含尿素和中性红的PEG溶液从内相入口进入，微通道中的双水相液滴形成并稳定后，通过显微镜镜头拍摄，记录微通道中液滴反应，追踪液滴反应中变色现象。

4.2   双水相液滴流中的酶促反应效率测定

为了获得脲酶反应的反应速率及转化率，用螺口玻璃瓶在微通道的末端收集，利用电导率仪检测收集液的电导率，空白样品为不加入尿素的双水相液滴流。在除去空白样品的电导率后，通过标准曲线(电导率对应碳酸铵浓度)确定产物碳酸铵的浓度值，再通过式(1)、(2)和(3)计算碳酸铵的反应速率vP(μmol/(mL ·s))、停留时间τ(s)和转化率Conversion(%)。

式中，L是微通道的长度(mm)，vD是液滴的流速(mm/s)，液滴的流速我们通过高清摄像头捕捉到的画面进行计算得出，cs和cp分别是底物和产物的浓度(μmol/mL)，转化率代表底物尿素被脲酶催化生成碳酸铵的转化率。

4.3   酶促反应速率在微流控双水相液滴流和烧杯中的比较

为了比较微液滴和传统烧杯之间的双水相酶促反应的差异，研究了两种体系下反应速率的差异。我们对比了在烧杯中的搅拌和静置两种体系的反应速率，将含有脲酶的Dex相倒入两个烧杯中。然后，将含尿素的PEG相用注射器缓慢地分别加入两个烧杯中Dex相的顶部，在其中一个烧杯中磁力搅拌(100 r/min)Dex相，另一个烧杯中保持静止状态。500 s后，测定酶促反应速率。

5  尿素检测及应用于土壤测定

为了探究该平台在检测尿素的应用，进行了不同尿素浓度下测定液滴颜色强度的实验。不同尿素浓度下，各相流量保证一致，酶质量浓度为1 mg/mL，中性红质量浓度为0.2 mg/mL。在避光条件下，在距离锥口1 cm处标记位置拍摄液滴照片，使用Image Pro Plus 6.0软件对液滴颜色强度进行分析。

取5 g土壤样本，使用氯化钾浸提剂将土壤中的氨氮浸渍出来。加25 mL质量分数为7.4%氯化钾溶液，混合均匀后，用震荡器震荡30 min。取10 mL浸渍液于15 mL离心管中，用离心机离心10 min，转速为3000 r/min。取上清液各2 mL，分别记为样品A和B[22]。样品A使用本微流控方法，将2 mL上清液稀释至10 mL后，再加入PEG，配制成质量分数为8%的PEG水溶液作为待测样品备用，进行微流控测定。样品B使用尿素测定仪法。分别进行3次重复测定，记录检测结果并进行对比。

 结果与讨论

1   双水相液滴的生成

微流控装置实物已在图 2A中展示，外管内径在1000 μm左右(图 2B)，毛细锥口的直径不到100 μm(图 2C)。图 2D为微流控装置的产生液滴流的性能测试，可以看到，当流量恒定时，微通道内可以产生大小均一且间距一定的双水相液滴。

图 2.  微流控装置的双水相液滴流

2   微通道中的酶促反应

中性红染色液滴探究酶促反应实验如图 3所示，图 3A为0 s时的液滴颜色，图 3B为5 s时的液滴颜色，图 3C为10 s时的液滴颜色，图 3D为20 s时的液滴颜色，图 3E、3F、3G和3H分别为对应液滴的放大图。随着液滴在微通道中运动时间的增加，液滴内指示剂中性红由红色变为黄色。这是因为反应前液滴内物质呈中性，指示剂为红色，反应后的产物碳酸铵为弱碱性，可使指示剂变为黄色。证明该体系下发生了酶促反应。

图 3.  中性红染色的PEG液滴在微通道中的变色过程

3   平均液滴直径对酶促反应的影响

不同液滴直径对酶促反应速率及转化率的影响如图 4所示。随着液滴直径的增大，酶反应速率(图 4A)和转化率(图 4B)会逐渐降低。这主要是由于，随着液滴直径增大，液滴的比表面积减小，液滴界面上的物质交换的几率降低，酶与底物传质速度开始降低，反应速率降低。转化率与反应速率的趋势一致，因为在相同时间下，转化率是由界面反应速率决定的。因此在相同流量、溶液浓度下，液滴直径越大，转化效率越低。后续分析检测，为了便于测量液滴颜色强度，选择了较大液滴直径550 μm。若实际分析测量液滴直径较小时，考虑到酶促反应速度较快，可将标记位置前移。

图 4.  平均液滴直径对酶反应速率(A)及转化率(B)的影响

4   酶促反应速率在微流控双水相液滴流和烧杯中的比较

本实验研究了微流控双水相液滴流和烧杯中酶促反应速率差异，如图 5所示，微流控双水相液滴流反应速率分别比没有搅拌和轻微搅拌的烧杯ATPS中的高约1087倍和700倍。产生差异的原因主要是液滴流比传统烧杯反应拥有更大的比表面积，更快的表面更新速率，并且液滴在流动状态下也增强了底物与酶的接触几率。本实验体系反应速度快的特点尤其适合于需要快速分析检测的场合。

图 5.  酶反应速率在液滴流和烧杯的比较

5   尿素检测方法的建立及应用于土壤中尿素的测定

为了将基于酶促反应的微流控双水相液滴流平台应用于尿素的分析检测，我们使用显微镜摄像头拍摄1 cm处标记位置液滴的照片，通过Image-Pro Plus 6.0软件对照片进行分析。由图 6可知，液滴红色强度随底物浓度的增加而减小。本实验测定液滴内红色强度，所以底物浓度越高，反应速率越快，生成产物越多，指示剂中性红由红色变为黄色越明显，红色的强度就越小。对于未知浓度尿素样品的检测可通过表 1，得出样品中的尿素浓度。

图 6.  尿素浓度对液滴颜色强度的影响

使用本微流控方法和尿素测定仪法分别对土壤中尿素进行平行测定。结果表明，(微流控方法)样品A液滴颜色强度为0.216。对比表 1，可得出结论样品中含有尿素且尿素质量浓度范围为0~0.5 mg/mL；(尿素测定仪法)样品B通过尿素测定仪得出的尿素质量浓度为0.008 mg/mL，与本研究方法结果一致，也证明本研究方法不受土壤中其他含氮化合物影响。

结论

本文构建了一个基于酶促反应的微流控双水相液滴流平台用于简便快捷的尿素检测。通过对中性红指示剂标记的液滴红色强度进行分析，实现了尿素浓度的可视化检测，检测范围为0~50 mg/mL，大大超过了市售仪器和试纸的检测范围。利用微液滴极大的比表面积和微米级的扩散距离进行酶促反应，其反应速率相比于传统烧杯实验显著提高，同时尿素检测时间缩短为20 s左右。双水相体系的使用，克服了传统油水分析检测平台生物相容性低的局限。我们期望该平台在日用化学品、农业土壤、水质、食品等分析检测领域得到广泛的应用。

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