通过微流控复制剪切介导的蜘蛛丝自组装（下）

剪切诱导结晶的定量

虽然上述展示了一种微流控平台，能够诱导重组MaSp2快速自组装成分层结构的纤维，以响应连续的生理触发，但另一个主要问题是这样的系统是否能够成功诱导β片结构的形成，这是蜘蛛丝拉伸强度的主要来源。

通过共聚焦拉曼光谱监测微流控芯片内蛋白质构象的变化，分辨率为0.8 cm−1（图3a）。从天然蜘蛛拉索丝纤维中收集的光谱用作参考，在1670（酰胺I，C = O拉伸），1615（Tyr），1452（CH3不对称弯曲，CH2弯曲），1242（酰胺III，N-H弯曲+ C-N拉伸），1175（Tyr）和~1078/1094 cm−1（骨骼Cα-Cβ拉伸）的预期位置产生了明确的峰。在这些峰中，酰胺I、酰胺III和骨架C-C峰对二级结构的变化很敏感，特别是关于β片构象31。通常，可以对酰胺I或III区域内的峰进行反卷积以计算二级结构组成32。然而，PDMS和盖玻片分别在1266和1098 cm−1处产生重叠信号，因此我们专注于酰胺I区域周围的区域，以定量分析二级结构含量。初步测试证实，在微流体环境之外，暴露于仿生化学触发物的三域MaSp2，但在没有机械变形的情况下，未能产生β片构象（图3b）;而作为阳性对照，经90%甲醇处理的MaSp2缩合物在1668 cm−1处产生了β片构象的特征酰胺I峰。

使用 N-R6-C、N-R12-C 和 N-R12-C（xA） 进行的拉曼测量揭示了在微流控装置中自组装过程中蛋白质二级结构的演变（图 3c），补充了观察到的形态变化。在LLPS液滴状态（A部分）期间，所有样品的光谱都与大部分无序/a螺旋构象一致，峰值为~1654 cm−1。值得注意的是，对于N-R12-C，观察到在~1664 cm−1处逐渐出现一个额外的峰，这归因于β片结构。从1580到1720 cm−1的酰胺I区域的反卷积提供了二级结构贡献的估计。如附表2所示，N-R12-C的估计β片含量从A部分的12.5%增加到B部分的22.5%，最后增加到C部分的最高29.2%。相比之下，对于N-R6-C，串联重复次数只有一半，尽管组装了形态相似的纤维，但未检测到明显的β片峰;我们假设触发 6 重复结构中结构变化的压力阈值高于 12 重复结构，施加的压力为 -90 kPa（我们系统的上限）显然不足以驱动 N-R6-C 中丰富的β片形成。同样，对于突变体N-R12-C（xA），没有观察到二级结构转变，这与聚丙氨酸形成蚕丝纤维β片晶体成分的基础一致。

值得注意的是，虽然N-R12-C在A段中受到的剪切力略高于B段（图4c，e），但在后一段中检测到β片含量的显着增加。因此可以推断，A部分中离子交换引发的剪切和LLPS的简单组合不足以诱导构象转变。因此，很明显，B部分中酸化引起的纤维化，以及相关的粘度增加，也是我们微流控系统中β片形成协同过程的必要先决条件。

为了检验触发β片涌现的阈值假设，在不同大小的负压下进行N-R12-C的微流控组装（图.3d）。在较低水平（-40至-50 kPa）下，没有获得纤维，而是蛋白质形成聚集体。相反，在-60至-90 kPa之间形成了分层纤维，负压的大小与β片构象的比例呈正相关（图3e）。有趣的是，−60 kPa被证实是蚕丝纤维形成的阈值压力，其平均β片含量为17.8%。随着压力的增加，β片含量逐渐增加21.5%（−70 kPa时）、23.7%（−80 kPa时）和28.9%（−90 kPa时）。假设如果压力超过受我们实验系统限制的−90 kPa，则可以在蚕丝纤维中诱导更多的β片。这一结果表明，通过施加压力的细微变化来调整纤维结构的潜力。

在离开蜘蛛的喷丝头后，通常会对拉丝进行进一步拉伸，以实现更高程度的结晶和取向。这种自然行为代表了与强制卷蚕丝和后拉丝纺纤维相同的原理。因此，我们研究了通过我们的微流控装置与手动拉丝纤维可以实现的β片形成的相对水平（图3f）。虽然使用手动拉伸方法无法诱导精确的 pH 梯度和剪切，但手动拉伸产生的伸长力通常被认为是强大的，并且是充分诱导β片的原因。虽然微流控系统可以驱动重组丝纤维的免提仿生组装，但与手动拉制相分离MaSp2（即使在较短的N-R6-C结构中产生β片）产生的纤维相比，所得纤维显示出较低的β片含量（补充表2）。这可能反映了纤维在空气中外部拉伸所产生的更大程度的机械变形，以及脱水效应。为了支持拉曼结果，广角X射线散射（WAXS）结果表明，通过不同纺丝方法形成的MaSp2纤维中β片纳米晶体的含量具有相同的趋势（补充图6）。峰（020）归一化后，峰（010）处的强度表明，手工拉丝纤维的相对结晶度与重复域内聚丙氨酸块数呈正相关。在没有聚丙氨酸块的情况下，充分手工拉丝制备的N-R12-C（xA）纤维的结晶度仍低于微流控纺丝制备的N-R12-C纤维。无论如何，这些结果表明，通过将水纺方法与机械后处理步骤相结合，可以进一步微调仿生丝的性能。

为了阐明MaSp2光纤组装机理，我们对器件运行过程中组件的分布和物理力的相互作用进行了数值模拟。在建模之前，进行了流变学实验，以探测浓度为5至150 mg/ml的N-R12-C溶液的粘弹性（图4a，b）。与其他重组 （NT2RepCT） 和天然螺旋体蛋白 36,37 的报告结果一致，N-R12-C 溶液表现出典型的剪切稀化行为，随着剪切速率的增加，粘度降低。在25 °C下剪切速率为1 s−1时，天然螺杆菌的剪切粘度约为103 Pa s，远高于N-R12-C（均低于10 Pa s）和NT2RepCT（均低于1 Pa s）。与重组螺旋体相比，天然螺旋体蛋白的浓度和分子量要高得多，因此可以解释这种显着差异。为了直接比较相同浓度（如100 mg/ml）下重组螺旋体之间的剪切粘度，N-R12-C表现出明显更高的剪切粘度（~2 Pa s），比NT2RepCT报告的剪切粘度（0.05–0.1 Pa s）高20倍以上，这可能归因于重复单元的数量不同（12次重复与2次重复）。在这项工作中，发现重复区域中的丙氨酸残基对螺旋体的粘度有显着贡献，与N-R12-C相比，N-R12-C（xA）的粘度较低。

剪切稀化机理尚不完全清楚，基于胶体和聚合物体系提出了两种理论38,39。在胶体系统中，流动过程中的相分离导致了剪切变薄行为，这种现象归因于聚合物系统中分子链的解开。由于N-R12-C是一种生物聚合物，可以剪切以诱导相分离，因此其剪切稀化行为非常符合这两种理论。使用Carreau模型拟合不同浓度下的粘度-剪切速率曲线，建立了非牛顿三维模型。通过这种方式，模拟了各种离子（柠檬酸盐、磷酸盐、氯离子和钠离子）、蛋白质浓度、剪切和伸长率/应力沿通道的分布。

在器件内部产生的物理力方面，正如设计所预期的那样，器件内的伸长流效应被最小化，A和C部分的非收敛通道中的值可以忽略不计（补充图9）。由于交叉几何形状，在A和B截面之间的阈值区域，材料蛋白质可能会施加一定的伸长应力，但在确认局部剪切应力比伸长应力高9倍以上后，我们认为其影响微不足道。

另一方面，剪切效应在整个通道的纤维组装过程中发挥了主导作用，从A段到C段的剪切富集区域（图4c）和MaSp2（图2a，b）的共定位一致，与比压相对应，我们的模型有效地预测了通道内剪切应力/速率的分布和值（图4d，e和补充图10）。如上所述，−60 kPa是微流控内部蚕丝纤维组装所需的临界压力，相当于72 Pa和52282 s−1的阈值剪切应力和速率。值得注意的是，MaSp2组装所需的估计剪切速率（52282 s−1）比天然螺旋体（1500–3500 s−1）40,41的报道高一个数量级。这一结果可以通过重组和天然螺旋蛋白在浓度、粘度和分子量（重复域长度）方面的差异以及计算建模中定义的旋转和边界条件来解释。仅观察到具有至少 12 个聚丙氨酸块的三域 MaSp2 纤维出现剪切诱导的 β 片，并且 N-R12-C 纤维内的 β 片含量估计在 18% 至 29% 之间，这是通过将剪切应力从 72 Pa 变化到 111 Pa 来调节的（图 4f）。显然，通过使用剪切流的分子动力学模拟，具有至少 6 个聚丙氨酸块且没有 CTD 和 NTD 的 MaSp1 纤维能够在高达 300–700 MPa42 的剪切应力下形成富含β片的结构。

LLPS是蚕丝组装过程中的第一步，对于负责分层组织的纳米纤维化至关重要（补充讨论）。与我们之前的研究一致12，必须需要完整的结构域才能实现 LLPS 和纳米纤颤以形成 MaSp2 纤维。迄今为止，驱动LLPS的潜在机制在很大程度上仍然未知。正如最近报道的那样，Tyr和Arg残基的功能类似于分子“粘物”，通过LLPS诱导螺旋体的相分离。在这项工作中，通过观察 N-R12-C（xA） 对 kosmotropic 阴离子触发的自发反应，Ala 残基，特别是串联形式（即聚丙氨酸块）被确认为影响 LLPS 的无关因素。同样，在N-R12-C（xA）纤维中，没有聚丙氨酸块，宏观上无法区分的分层结构，因此没有看到纳米纤维颤动受到抑制（图5a）。

在没有使用成熟的液晶和胶束理论的情况下，LLPS被当作一个范式，以适当地理解我们仿生纺丝系统中的丝自组装过程（补充讨论）。将天然样触发器依次引入微流体通道以产生离子和 pH 梯度，从而将 MaSp2 诱导到含有固体纳米纤维的纤维中（图 5b）。化学和物理触发因素都是必需的，并且协同作用于纤维的形成，但后者在二级结构的转变中起着主导作用。应用微流控系统来控制剪切是灵活的，这在这项工作中得到了强调，以研究其对结晶的影响。通过调节剪切应力，有望制造出具有微妙调谐的β片结构的人造丝纤维。

综上所述，通过使用微流控装置，我们报道了一种仿生策略，用于探测从LLPS到纳米纤维化再到分层组织纤维的天然组装过程中的β片发展。本工作为仿生纺纱在域结构、微流控制备、剪切阈值和层次重构方面的合理设计提供了依据。未来的工作将集中在研究仿生纺纱条件下组合的 MaSp1 和 MaSp2 螺旋体的丝组装。将全面评估CTD和/或NTD形成的异二聚化，以更好地了解天然纺丝过程中螺旋体之间的相互作用。此外，基因序列中的特定氨基酸残基将被编辑/取代，以探索LLPS的潜在机制。

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