液滴微流控技术在微生物研究中的应用下

3.   基于液滴的共培养技术研究微生物相互作用

微生物相互作用是微生物群落功能和动态的主要驱动因素，利用液滴微流控技术在液滴中对微生物进行共培养，非常适用于高通量地研究微生物在各种环境下的相互作用。PARK等首先使用微液滴进行细菌共培养，当两个交互共生的菌株被封装进同一个液滴时，它们都可以生存和繁衍。TAN等在液滴中共培养粪便样本中的亚群落，分离出22个有较强的细菌共生长的液滴，并进行基因组测序以研究细菌亚群落的特征。这一技术也可用于研究微生物的跨界相互作用。JAROSZ等用液滴微流控技术共培养酵母和细菌，发现少数细菌可诱导酵母的代谢转化，这一策略可用于微生物次级代谢物的筛选。LAM等利用液滴微流控共培养技术研究肺炎球菌间的基因水平转移，发现在短期的细胞间相互作用后，发生了多次重合转移和大块或大片的转移。HSU等将两个或三个菌种随机混合封装到液滴中进行多个亚群落的平行培养，结合荧光显微镜和计算机快速的测定上千个液滴中每个菌种的绝对丰度，成功构建出不同环境中微生物群落复杂的相互作用网络。

基于液滴的高通量共培养和分离技术可用于筛选具有抗菌活性的益生菌。利用这一策略，SALESKI等成功从大肠杆菌突变文库中分离出一株高异丁醇产生能力的菌株。在另一个报道中，研究人员将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）与西伯利亚熊的口腔微生物组置于微流控液滴中共培养，成功筛选出一株有抗金黄色葡萄球菌活性的芽孢杆菌。

4.   抗生素敏感性试验

基于微流控的细菌培养方法是进行自动且快速抗生素敏感性试验的一个很有前景的工具。近年来，多种基于微流控的方法被开发出来用于抗生素敏感性试验，比如微室、微通道和基于液滴的方法，其中，基于液滴的方法由于其能产生大规模的超小体积液滴用于高通量和高敏感性的检测而被广泛使用。

BOEDICKER等最早开发了用于抗生素敏感性试验的液滴微流控平台，可在7 h内对多种药物在多个不同的浓度进行试验。KAUSHIK等开发了dropFAST平台，将抗生素和活细胞指示剂刃天青以及单一细菌封装在皮升级的液滴中，培养1 h后，测定液滴中的荧光强度用于对活细菌进行定量并评估抗生素敏感性。为了进一步增大测试通量，POSTEK等开发了一种微流控平台，可以产生一系列乳状液，每份乳状液都含有密集的液滴，并通过第三不互溶相彼此分离。单个细菌被封装在液滴中，每份乳状液包含不同浓度的抗生素和相同浓度的细菌。这一系统使得在单次实验中可对单个细胞的抗生素敏感性试验在一系列抗生素浓度上进行上百次试验。KANG等设计了一种由4个集成微液滴阵列组成的平台，每个微滴阵列承载8000多个对接点，可同时筛选四种抗生素/病原体组合，在15~30 min内进行抗生素敏感性评估。

液滴微流控技术也能用于评估抗病毒药物。MASHAGHI等设计了一种用于筛选候选化合物的病毒融合试验。采用定量荧光探针，在亚秒时间分辨率上测定了甲型流感病毒与微滴中靶脂质体的融合动力学数据。从候选药物在病毒融合动力学方面的特征可获取药物作用机制的相关信息。此外，为了确定潜伏期逆转剂对HIV再激活的影响，研究者开发了一种用于高通量封装HIV感染细胞和直接鉴定HIV感染细胞的微流控装置。利用其对从接受抗逆转录病毒治疗的患者获得的单个CD4+ T细胞进行分析发现，潜伏期逆转剂在某些情况下增强了活性细胞的转录，而在其他情况下增加了转录活性细胞的数量。

5.   工程菌株与微生物资源开发

液滴微流体为菌株改良、代谢产物筛选和生物合成基因簇发现提供了一个有效的平台。JIAN等设计了一种微生物微滴培养系统，该系统在多达200个液滴中自动执行微生物培养、生长监测和适应性进化，在该系统中对甲醇必需型大肠杆菌菌株进行了为期18 d的适应性进化，获得了两株生长速度比亲本菌株更快的菌株。将可能产生氨基酸的菌株和报告菌株封装在液滴中，可以识别自然分泌氨基酸的菌株，研究人员用该方法分离出了三株突变的乳酸乳球菌菌株，与野生型相比，氨基酸分泌增加了5~10倍。MAHLER等将报告菌株注射到所有液滴中，对来自自然微生物群落的抗生素产生株进行了高通量筛选。

将宏基因组文库构建与液滴筛选相结合，有助于从微生物中发现生物合成基因簇。MA等建立了生活自来水样品中大肠杆菌的宏基因组文库，结合液滴微流控技术，他们鉴定到了一种催化效率高、进化起源与其他脂解酶不同的新型酯酶。相似的手段也被用于从黏液相关的肠道微生物群中筛选宿主聚糖降解酶类，结果揭示了肠道细菌尤其是致病菌代谢人类聚糖的新途径。XU等开发了一种微流控自动质粒文库富集系统用于对微生物的生物合成基因簇进行分离和测序，该系统已成功应用于从南极土壤宏基因组中分离并测定了Ⅰ型聚酮合酶基因簇序列。

液滴微流控技术也可用于定向进化，定向进化是蛋白质工程中一种常用的方法，通过模拟自然选择过程，引导蛋白质或核酸实现所需功能。液滴微流体技术能进行高通量分选的优势使其成为进行定向进化的理想平台。VALLEJO等建立了一种荧光激活的液滴分选装置，以进化用于合成和修饰人工遗传聚合物的酶。ZURKE等通过在微液滴中进行单细胞培养，将酶活性测定的灵敏度和DNA回收率提高了一个数量级，使蛋白质工程更易于识别或进化出可应用于合成和化学生物学的新酶。

6.   总结与展望

液滴微流控作为一个高通量高分辨率且高度集成化的新兴技术平台，可与多种检测技术结合，在从微生物培养到微生物组学研究再到微生物资源开发利用等方面扮演重要的角色。由于其独特的优势，液滴微流体技术有望成为微生物学家探索微生物世界的基础技术工具。目前液滴微流控技术仍面临着一些挑战。首先，液滴微流控技术用于微生物研究仍有一些技术局限需要突破，如液滴中物质交换能力有限、难以解决不同微生物种类的需氧量差异等问题。此外，还缺乏标准化的设备和操作流程，只有少量的液滴微流控设备用于特定需求的分析，大多数利用液滴微流控技术的研究仍需要研究人员自己设计并制作微流控设备，设备的制作和操控均存在很大挑战。因此，未来需要对液滴微流控系统进行自动化和简约化改进，为其在微生物研究中的应用提供全方位、标准化的设备和操作流程，继续创新和改进下游的分析手段。相信随着微流控技术的发展，在多学科的高度配合下，液滴微流控技术进一步发展和成熟直至走进每一个微生物实验室，服务微生物学科的研究发展将成为现实。

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